Sequenciação Sanger vs. Sequenciação de Nova Geração (NGS)

Introdução

Dentro da esfera de Sequenciação de DNAduas metodologias inovadoras - Sequenciação de Sanger e Sequenciação de Nova Geração (NGS) - transformaram as ciências biológicas. Cada uma destas técnicas opera com base em princípios distintos e é aplicada a uma variedade de funções que se adequam de forma única à investigação. Ambas apresentam as suas vantagens e restrições individuais. Compreender as disparidades entre o sequenciamento Sanger e o NGS é vital para cientistas e clínicos, uma vez que informa fortemente o desenho experimental, a interpretação dos dados derivados e, em última análise, o resultado geral da investigação realizada. Este texto discursivo inicia uma comparação exploratória entre o sequenciamento Sanger e o NGS, examinando os seus respetivos benefícios, as limitações que impõem e o contexto em que estas aplicações são adequadamente empregues.

Diferenças entre NGS e Sequenciação Sanger

Princípio de Funcionamento

Sequenciação de Sanger, reconhecido como sequenciação por eletroforese capilar, opera integrando didesoxirribonucleotídeos marcados com fluorescência (ddNTPs) durante a síntese de DNA. Cada ddNTP interrompe a elongação da cadeia de DNA em locais nucleotídicos precisos, facilitando a determinação da sequência de DNA através da eletroforese capilar.

Em contraste, NGS utiliza uma variedade diversificada de mecanismos, incluindo química de terminadores reversíveis, sequenciação de moléculas únicas em tempo real e sequenciação baseada em nanoporos, para realizar sequenciação em alta capacidade.

Desempenho e Escalabilidade

A marca distintiva de NGS reside na sua notável capacidade de rendimento e escalabilidade. As plataformas de NGS demonstram a capacidade de sequenciar uma multitude de fragmentos de DNA dentro de um único ciclo operacional, facilitando assim uma ampla cobertura genómica e análise simultânea que abrange centenas a milhares de genes ou regiões genéticas. Esta característica supera de forma significativa o rendimento limitado inerente à sequenciação Sanger, que processa convencionalmente os fragmentos de DNA em série, um de cada vez.

Sensibilidade e Limite de Detecção

NGS oferece uma sensibilidade superior em comparação com Sequenciação de Sanger, particularmente na deteção de variantes de baixa frequência e mutações raras. A capacidade de sequenciação profunda do NGS permite a identificação de variações genéticas subtis presentes em frequências tão baixas quanto 1%. Em contraste, a sequenciação Sanger pode apresentar uma sensibilidade inferior, com um limite de deteção tipicamente em torno de 15-20%.

Poder de Descoberta

NGS destaca-se na revelação de variantes novas e revelações genéticas atribuíveis à sua capacidade de alto rendimento e ampla cobertura do genoma. Os académicos que utilizam a tecnologia NGS podem desvendar variações genéticas até então não notadas e alcançar uma compreensão mais profunda das complexidades e da diversidade genética. Embora Sequenciação de Sanger mantém a precisão e a fiabilidade, pode ficar aquém no domínio da potência de descoberta proporcionada pelas plataformas de NGS.

Comparação entre o sequenciamento Sanger e as tecnologias de NGS.

Benefícios do Sanger vs Illumina

Sequenciação Rápida e Custo-Eficaz para Alvos de Baixo Número:

Sequenciação de Sanger permanece uma opção viável para sequenciar um número limitado de alvos, como genes únicos ou fragmentos curtos de ADN. A sua familiaridade, robustez e custo-eficácia tornam-na adequada para projetos de sequenciação em pequena escala que exigem alta precisão e especificidade. Além disso, a sequenciação de Sanger pode ser realizada sem a necessidade de etapas complexas de preparação de bibliotecas, oferecendo um fluxo de trabalho simples.

Fluxo de Trabalho Familiar e Maior Profundidade de Sequenciação:

Sequenciação de Sanger apresenta um fluxo de trabalho familiar a muitos laboratórios de investigação, solidamente estabelecido ao longo do tempo. Pesquisadores experientes em sequenciação Sanger podem aproveitar os seus benefícios para a sequenciação direcionada de regiões genómicas ou genes específicos. Além disso, a sequenciação Sanger pode alcançar uma profundidade de sequenciação aprimorada, facilitando assim uma maior sensibilidade na deteção de variantes que ocorrem em baixas frequências.

Limitações do Sanger em comparação com Illumina

Largura de banda e escalabilidade limitadas:

Apesar da sua notável precisão e fiabilidade, Sequenciação de Sanger é prejudicada por uma diminuição na capacidade de processamento e escalabilidade em contraste com as tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração (NGS). Os protocolos laborais intensivos intrínsecos ao sequenciamento Sanger limitam a sua utilidade em empreendimentos de sequenciamento em grande escala que exigem um elevado rendimento de amostras. Além disso, com o aumento no número de alvos, a relação custo-eficácia do sequenciamento Sanger diminui, tornando-o menos adequado para análises genómicas abrangentes.

Custos Elevados para Alvos de Alto Volume:

Sequenciação de Sanger pode incorrer em despesas exorbitantes quando encarregado de sequenciar uma quantidade substancial de alvos (>20), uma vez que cada alvo normalmente exige reações de sequenciação individuais. O custo cumulativo que abrange reagentes, mão de obra e instrumentação associada à sequenciação Sanger pode ultrapassar as suas virtudes de precisão e metodologia estabelecida, particularmente em ambientes de elevado rendimento.

Comparação entre Sequenciação Sanger e NGS

Sequenciação de Sanger e NGS incorporar metodologias divergentes em Sequenciação de DNA, cada uma caracterizada por vantagens e limitações distintas. Discernir os méritos e desvantagens relativas dessas abordagens é fundamental para a seleção judiciosa de estratégias de sequenciação adaptadas a requisitos específicos de investigação ou clínicos.

Ao delinear os atributos nuançados do sequenciamento Sanger e do NGS, os investigadores podem navegar nas complexidades das metodologias de sequenciamento com precisão informada, alinhando a sua escolha com as exigências do domínio investigativo ou clínico em questão.

Vantagens do NGS em relação ao Sequenciamento Sanger

Sensibilidade Amplificada e Capacidade de Descoberta

Uma vantagem fundamental que distingue NGS de Sequenciação de Sanger reside na sua sensibilidade amplificada e capacidade de descoberta. As metodologias de NGS, caracterizadas pelo seu paradigma de sequenciamento massivamente paralelo, destacam-se na distinção de variantes genéticas raras ou de baixa frequência com uma profundidade sem igual. Esta sensibilidade aumentada assume uma importância primordial em aplicações que necessitam da revelação de mutações novas ou marcadores genéticos infrequentes. Notavelmente, no âmbito da investigação do câncer, onde mutações subtis podem precipitar a progressão da doença, a sensibilidade aumentada do NGS capacita os investigadores a delinear o completo espectro de alterações genéticas presentes nos genomas tumorais. Tal sensibilidade potencia iniciativas em medicina de precisão ao facilitar a identificação de alvos genéticos acionáveis, promovendo assim estratégias de tratamento personalizadas.

Tempo de Resposta Rápido e Escalabilidade

NGS apresenta uma vantagem conspícua em termos de tempo de resposta e escalabilidade quando comparado com Sequenciação de SangerDevido à sua capacidade de sequenciar simultaneamente milhões de fragmentos de ADN numa única operação, as plataformas de NGS reduzem significativamente a duração necessária para gerar dados genómicos abrangentes. Este aumento da capacidade de processamento assume uma importância particular em contextos caracterizados por altos volumes de amostras, como estudos populacionais extensos ou instalações de diagnóstico clínico que processam inúmeras amostras diariamente. Além disso, a escalabilidade inerente ao NGS permite que os investigadores expandam os seus esforços de sequenciamento de forma fluida, acomodando projetos que abrangem uma variedade de magnitudes sem comprometer a eficiência ou a relação custo-eficácia. Consequentemente, o NGS emergiu como a modalidade preferida para empreendimentos que exigem aquisição e análise de dados rápidas em diversos terrenos genómicos.

Quando Usar NGS vs. Sequenciação Sanger

Sequenciação de Sanger: Análise Focada e Investigações de Gene Único

Sequenciação de Sanger mantém o seu papel central como uma ferramenta valiosa para análises focadas e estudos de genes únicos, particularmente em contextos onde a precisão e a fiabilidade têm prioridade. Beneficiando de protocolos meticulosamente estabelecidos e taxas de precisão notáveis, o sequenciamento de Sanger destaca-se em cenários que exigem o sequenciamento de genes individuais ou fragmentos de DNA concisos. Além disso, o sequenciamento de Sanger prova ser economicamente viável para empreendimentos que envolvem um número restrito de alvos ou amostras, tornando-o bem adequado para estudos de pequena escala ou ensaios diagnósticos que se concentram em loci genéticos específicos. Além disso, a familiaridade e a natureza amigável do sequenciamento de Sanger tornam-no acessível a laboratórios de diferentes níveis de especialização, garantindo assim resultados consistentes em diversos ambientes de pesquisa.

NGS: Genómica de Alto Rendimento e Análise Abrangente

NGS emerge como a abordagem preferida para genómica de alto rendimento e escrutínio genómico exaustivo, apresentando um rendimento e uma abrangência de cobertura incomparáveis. A sua capacidade de escrutinar simultaneamente centenas a milhares de genes capacita os investigadores a dissecá-los sistemas biológicos complexos e a revelar novas variantes genéticas que abrangem genomas inteiros ou regiões específicas. Além disso, a sensibilidade e escalabilidade aumentadas do NGS tornam-no bem adequado para aplicações que necessitam da análise de diversos tipos de amostras ou coortes extensas, como genómica em escala populacional ou ensaios clínicos. Ao aproveitar as capacidades do NGS, os investigadores estão prontos para descobrir novas perspetivas sobre as bases genéticas da doença, abrindo assim o caminho para avanços em diagnósticos, terapêuticas e medicina personalizada.

Ambos Sequenciação de Sanger e NGS desempenham papéis fundamentais no campo da genómica, oferecendo vantagens e aplicações distintas. Enquanto o sequenciamento de Sanger continua a ser uma escolha fiável para análises direcionadas e estudos de um único gene, o NGS emerge como uma tecnologia transformadora, capacitando a genómica de alto rendimento e a análise genómica abrangente.

Aplicações de NGS (Evelien M. Bunnik et al., 2012)

Sequenciação Illumina vs PacBio

Sequenciação Illumina, uma pedra angular de NGS A tecnologia catalisou uma mudança de paradigma na pesquisa genómica devido às suas capacidades de alto rendimento e precisão. A sua utilidade abrange um amplo espectro, desde o sequenciamento de genomas completos até à análise de amplicões direcionados. A adoção generalizada da Illumina é sustentada pela sua resiliência, precisão e custo-efetividade, tornando-a a opção preferida para investigações genómicas em grande escala, inquéritos de genética populacional e diagnósticos clínicos.

Sequenciação PacBioConhecida coloquialmente como sequenciação em tempo real de moléculas únicas (SMRT), introduz uma dimensão distinta à análise genómica através da sua capacidade de gerar leituras longas. Divergindo da Illumina, a sequenciação PacBio dispensa a necessidade de amplificação de template, mitigando os preconceitos e erros comumente associados à PCR. Ao monitorizar a incorporação em tempo real de nucleotídeos, a sequenciação PacBio fornece insights sem precedentes sobre paisagens genómicas complexas, elucidando variações estruturais, elementos repetitivos e modificações epigenéticas.

Sequenciação PacBio vs Sequenciação Nanopore

Sequenciação PacBio destaca-se pela sua capacidade de gerar leituras extensas, proporcionando insights inestimáveis sobre variações estruturais e arquitetura genómica. Ao observar o processo de sequenciação em tempo real, o PacBio produz leituras que abrangem milhares de pares de bases, facilitando a caracterização precisa de regiões genómicas complexas. Esta capacidade torna a sequenciação PacBio indispensável para diversas aplicações, incluindo montagem de genomas de novo, faseamento de haplótipos e análise do transcriptoma completo.

Sequenciação por nanopore destaca-se pela sua portabilidade e capacidades analíticas em tempo real, oferecendo uma ferramenta versátil para investigação de campo e diagnósticos à beira do leito. Através da passagem de cadeias de ADN por nanoporos embutidos em membranas lipídicas, a sequenciação por Nanopore distingue alterações nas correntes elétricas, permitindo a determinação direta de sequências de nucleotídeos. Esta tecnologia elimina a necessidade de configurações laboratoriais elaboradas, facilitando análises genómicas rápidas e no local. As aplicações da sequenciação por Nanopore abrangem a vigilância de doenças infeciosas, monitorização ambiental e genómica personalizada, sublinhando a sua ampla utilidade em diversos domínios.

Nanopore vs Sequenciação Illumina

Sequenciação por nanoporoA portabilidade e as capacidades analíticas em tempo real permitem que os investigadores realizem investigações genómicas em ambientes remotos ou com recursos limitados. Ao aproveitar dispositivos portáteis como o MinION, os investigadores podem executar experiências de sequenciação além dos limites convencionais de laboratório, abrindo novas avenidas para a pesquisa em campo e diagnósticos no ponto de cuidado. A proficiência da Nanopore em sequenciar diretamente leituras longas de moléculas de DNA ou RNA confere vantagens em diversos domínios, incluindo montagem de novo, transcriptómica e metagenómica.

O sequenciamento Illumina, distinguido pela sua incomparável capacidade de produção e precisão, é o padrão para investigações genómicas em grande escala e diagnósticos clínicos. Ao gerar milhões de leituras curtas em paralelo, o sequenciamento Illumina garante uma cobertura exaustiva do genoma, facilitando a descoberta de variantes, o perfil de expressão génica e investigações epigenéticas. A sua robustez e custo-efetividade tornaram-no indispensável em empreendimentos que necessitam de dados genómicos de alta resolução, abrangendo áreas como a genómica do cancro, genética populacional e investigação de doenças infeciosas.

Em resumo, Sequenciação de Sanger e NGS tecnologias como Illumina, PacBio, e Sequenciação por nanoporo oferecem forças complementares na análise genómica. Aproveitar a proficiência da CD Genomics nestas plataformas de sequenciação proporciona aos investigadores acesso a uma vasta gama de soluções genómicas, capacitando-os a explorar as complexidades do genoma e a embarcar em novas fronteiras na investigação biológica e no diagnóstico clínico.

Referências:

1. Bunnik EM, Le Roch KG. Uma Introdução à Genómica Funcional e Biologia de Sistemas. Cuidados Avançados de Feridas (New Rochelle). 2013
2. Andrew D. Young, Jessica P. Gillung Filogenómica — princípios, oportunidades e armadilhas da filogenética de grandes dados. Entomologia Sistemática 2019