Sequenciação do Genoma Humano Completo por PacBio SMRT

A CD Genomics tem fornecido um serviço de re-sequenciamento do genoma humano preciso e acessível há alguns anos. A CD Genomics apresenta anteriormente oculto Tecnologia SMRT da PacBio que tem um grande potencial de aplicação no re-sequenciamento do genoma humano. As leituras longas de moléculas únicas revelam variantes estruturais e produzem informações diretas de fase de variantes através de blocos de haplótipos e metilação. Isto é muito útil para alargar a utilidade dos esforços de medicina de precisão para melhorar a saúde humana e promover grandemente o desenvolvimento de doenças genéticas únicas, doenças complexas e genomas tumorais.

A Introdução do Sequenciamento do Genoma Humano Completo PacBio SMRT

Ter um mapa abrangente das variações genómicas humanas é de extrema importância para uma compreensão aprofundada dos traços genéticos e para fortalecer a investigação precisa de doenças. Embora o sequenciamento de leituras curtas possa detectar de forma fiável pequenas variações, como SNP (Polimorfismos de Nucleotídeo Único) e InDels (Inserções e Deleções), apresenta uma sensibilidade limitada na identificação de CNVs (Variações no Número de Cópias) e SVs (Variações Estruturais). Nos últimos anos, sequenciação de leitura longa tem ganho uma utilização generalizada na pesquisa genómica humana. Esta técnica decifra eficazmente estruturas genómicas complexas, incluindo regiões genéticas altamente repetitivas e variações estruturais do genoma, o que oferece uma perspetiva genómica mais abrangente na busca por variações associadas a doenças. A alta precisão de sequenciação de leitura longa permite descobrir variações raras que o sequenciamento de leituras curtas pode perder, proporcionando assim informações mais precisas sobre variações genéticas, um input essencial para a medicina de precisão e a sua pesquisa fundamental.

A Sequenciação do Genoma Humano com a Tecnologia de Molécula Única em Tempo Real da Pacific Biosciences (PacBio SMRT) é uma tecnologia avançada de análise genómica que incorpora a propriedade. Sequenciação SMRT abordagem desenvolvida pela Pacific Biosciences. Esta tecnologia destaca-se pela sua capacidade de gerar comprimentos de leitura prolongados, demonstrar alta precisão de sequência e oferecer deteção direta de modificações epigenéticas, permitindo assim uma análise abrangente e profunda do genoma humano. Notavelmente, Sequenciação SMRT da PacBio é capaz de gerar leituras extraordinariamente longas que normalmente variam de 10 a 15 quilobases (kb) e, em alguns casos, até superam esse comprimento. Esta característica revela-se especialmente benéfica para decifrar estruturas genómicas intrincadas, como regiões caracterizadas por um elevado grau de repetição de sequência ou variação estrutural.

A CD Genomics agora emprega Sequenciação SMRT da PacBio para realizar uma análise abrangente de genomas humanos completos. Com a capacidade de realizar sequenciação do genoma completo através de várias amostras a nível individual e populacional, seguidas de uma profunda análise bioinformática em ambos os níveis, este método abre caminho para a ampla exploração das variações genómicas. Tais variações incluem Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs), Inserções e Deleções (InDels), Variações no Número de Cópias (CNVs) e Variações Estruturais (SVs). Os íntimos insights genómicos derivados desta exploração direta e extensa são indispensáveis na identificação de genes patogénicos e de susceptibilidade, bem como na compreensão dos mecanismos subjacentes ao início da doença e aos padrões de herança.

Vantagens da Sequenciação do Genoma Humano Completo por PacBio SMRT

• Leituras longas. É benéfico para a mineração de informações de variação de todo o genoma, análise precisa de variantes estruturais cromossómicas (SVs) e genes de fusão.
• Sem amplificação por PCR. Evitando efetivamente o viés de amplificação e abrangendo facilmente regiões com alto conteúdo de GC e alta repetição de sequências, para garantir a integridade e homogeneidade da cobertura do genoma.
• Detecta diretamente modificações epigenéticas ao medir a variação cinética durante a incorporação de bases.

Aplicação do Sequenciamento PacBio SMRT do Genoma Humano Completo

Deteção de SV

Os SVs representam rearranjos genómicos (tipicamente definidos como superiores a 50 bp), e os SVs podem desempenhar papéis importantes na doença humana, evolução e diversidade genética. Muitas doenças hereditárias e cancros têm sido associados a um grande número de SVs nos últimos anos. Tem havido um progresso tremendo na deteção de variantes de nucleótido único (SNVs) no último quarto de século, mas variantes estruturais de tamanho intermédio (50 bp a 50 kb) (SV) continuam a ser um desafio com leituras curtas. Sequenciação de ADNO comprimento de leitura mais longo das sequências PacBio SMRT é de 40 a 70 K, o que pode facilmente cobrir áreas de alta repetição e alta heterozigosidade, proporcionando a possibilidade de deteção de SVs.

2. Genotipagem de Haplótipos

Um haplótipo (genótipo haploide) é um grupo de alelos num organismo que é herdado em conjunto de um único progenitor. O correto genotipagem o gene do haplótipo é importante; por exemplo, o resultado do transplante de medula óssea de doador não relacionado é influenciado pelo emparelhamento do doador e do recetor para HLA. As leituras longas da PacBio podem abranger múltiplos nucleotídeos únicos e variantes estruturais, o que faseia diretamente as variantes em haplótipos.

3. Metilação do DNA

A metilação do DNA é um processo pelo qual grupos metilo são adicionados à molécula de DNA. É essencial para o desenvolvimento normal e está associada a vários processos-chave, incluindo impressão genética, inativação do cromossoma X, repressão de elementos transponíveis, envelhecimento e carcinogénese. Existem várias formas de detetar a metilação do DNA, incluindo sequenciação de bisulfito de genoma completo (WGBS), Sequenciação por Imunoprecipitação de DNA Metilado (MeDIP) e assim por diante. Mas estes métodos são difíceis de operar experimentalmente.

Enquanto a plataforma PacBio pode descrever a deteção direta da metilação do DNA, sem conversão por bisulfito, de acordo com a diferença no intervalo do sinal de pulso de fluorescência. Além disso, o sequenciação de leituras longas permite uma avaliação mais completa da metilação de CpG regional e aumenta a capacidade de estudar a relação entre variantes de nucleotídeo único em fase e a metilação de CpG específica de alelo.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação do Genoma Humano com PacBio SMRT

Especificação de Serviço

	Requisitos de Amostra Quantidade de ADN: ≥ 3 μg, Concentração ≥ 80 ng/µL Pureza do DNA: OD260/280 = 1,8 ~ 2,0 sem degradação ou contaminação por RNA
	Estratégia de Sequenciamento Biblioteca de 20 kb ≥ 10X profundidade de cobertura do genoma
	Análise Bioinformática A CD Genomics oferece serviços de análise de dados estatísticos e bioinformáticos em: Deteção de SV Genotipagem de Haplótipos Metilação do DNA serviços de bioinformática personalizados

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação do Genoma Humano Completo PacBio SMRT para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece um pacote completo de serviços de re-sequenciamento de genoma completo, incluindo padronização de amostras, construção de bibliotecas, sequenciamento profundo, controlo de qualidade de dados brutos, e bioinformática análise. Podemos adaptar este pipeline ao seu interesse de pesquisa. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Resultados da Demonstração

Perguntas Frequentes sobre Sequenciação do Genoma Humano com PacBio SMRT

1. Qual é a profundidade do re-sequenciamento do genoma humano completo?

A profundidade de sequenciamento é determinada pelo propósito da pesquisa, número de amostras e suas necessidades. A profundidade geral do re-sequenciamento do genoma humano é de 30X. Para a deteção de variações germinativas, recomendamos uma profundidade de sequenciamento de 30-50X, como em pesquisas sobre doenças de gene único. Para estudos populacionais com múltiplas amostras, se você se concentrar em SNP, uma profundidade de sequenciamento de 10X é suficiente. Se você se concentrar em variações estruturais em tecidos cancerígenos, recomendamos que a profundidade de sequenciamento seja superior a 50X.

2. Que métodos podem ser utilizados para validar os resultados?

Re-sequenciamento do genoma completo pode detectar diferentes tipos de variações genéticas, incluindo SNP, InDel, SV e CNV.

• Amplificação e sequenciação de PCR ou Genotipagem de SNPs pode ser utilizado para validar SNPs.
• amplificação por PCR e Sequenciação de Sanger pode ser utilizado para validar InDels de fragmentos curtos.
• A PCR em tempo real é útil para validar CNVs.
• SVs de pequena escala podem ser validados por amplificação por PCR e sequenciação, enquanto SVs de grande escala precisam ser validados por observação microscópica, como FISH.

3. Quais são as vantagens do sequenciamento de genoma completo de terceira geração em relação ao sequenciamento de genoma completo de segunda geração?

Em contraste com a segunda geração sequenciação de genoma completo, que utiliza a construção de bibliotecas envolvendo fragmentos de DNA de aproximadamente 350 pares de bases (pb) e emprega uma abordagem de sequenciação de extremidades pareadas 150 (PE150), a sequenciação de genoma completo de terceira geração lida tipicamente com fragmentos maiores do que 10 quilobases (Kb), com a capacidade de se estender até vários megabases (Mb). Esta característica confere vantagens particulares na deteção de variações estruturais de grandes segmentos e variações em regiões complexas. Além disso, a sequenciação de genoma completo de terceira geração dispensa a necessidade de amplificação por PCR, permitindo assim a extração simultânea de informações de metilação.

4. Por que usar sequenciação de leituras longas para detectar variações estruturais (SV)?

variantes estruturais (SV), compostas por deleções, inserções, duplicações e inversões, constituem a maioria dos pares de bases variantes em um genoma humano individual. Muitos estudos demonstraram uma relação direta ou indireta entre os SVs implicados na saúde humana e os seus fenótipos associados. Consequentemente, identificar variantes genéticas e compreender as suas implicações funcionais está entre as questões mais críticas na pesquisa genética humana. Dada a tendência dos SVs de surgirem em regiões repetitivas e a possível complexidade da estrutura intra-SV, descobrir estas variantes e realizar genotipagem pode apresentar desafios significativos. Portanto, a necessidade de tecnologias de sequenciação de leitura longa iniciar novas investigações sobre estruturas de SV e realizar análises sobre a deteção de SVs na população humana é fundamental para compreender doenças relacionadas com SVs.

5. Como é realizado o Controlo de Qualidade dos Dados?

O controlo de qualidade dos dados envolve várias etapas para garantir a alta qualidade dos dados de sequenciação:

• Avaliação da Distribuição do Comprimento das Leituras: Inspecionar a distribuição do comprimento das leituras geradas para garantir que cumpre as expectativas.
• Avaliação da Taxa de Erro: Avaliação das taxas de erro de sequenciação utilizando sequências de controlo interno ou genomas de referência.
• Avaliação da Cobertura: Analisando a profundidade e a uniformidade da cobertura do genoma para garantir uma cobertura de dados suficiente.

6. Como Selecionar a Profundidade de Sequenciação Apropriada?

A escolha da profundidade de sequenciação depende dos requisitos e objetivos específicos do estudo:

• Montagem do Genoma Completo: Geralmente requer uma maior profundidade de cobertura para garantir a integridade e a precisão da montagem.
• Deteção de Variantes: Uma profundidade de cobertura moderada pode ser suficiente para detectar SNPs e InDels, mas a deteção de CNVs e SVs pode exigir uma cobertura mais elevada.
• Análise de Modificação Epigenética: A profundidade de cobertura deve ser suficientemente alta para garantir a deteção fiável dos sinais de modificação.

Estudos de Caso de Sequenciação do Genoma Humano com PacBio SMRT

Detetar uma variante de inserção longa em SAMD12 por sequenciação SMRT: implicações da sequenciação de genoma completo de leitura longa para doenças de expansão de repetição

Revista: Revista de Genética Humana
Fator de impacto: 5,881
Publicado: 17 de dezembro de 2018

Fundo

Leitura curta sequenciação de nova geração (NGS) é amplamente utilizada em investigação médica e testes genéticos para detetar variantes patogénicas de nucleótido único e pequenas inserções e deleções (indels). No entanto, esta tecnologia pode não detetar variações estruturais (SVs) que abrangem centenas a dezenas de milhares de pares de bases. Tecnologia de sequenciação de leitura longa oferece promessas na deteção fiável de novos SVs. A BAFME, uma doença neurológica autossómica dominante caracterizada por mioclonia tremulante e convulsões infrequentes, está associada a expansões de repetições no SAMD12 gene. Sequenciação SMRT da PacBio, capaz de ler DNA de mais de 10 kb, tem o potencial de cobrir completamente o SAMD12 expansão de repetições. Leitura longa sequenciação do genoma completo O uso do PacBio pode ser útil para detectar SVs patogénicos conhecidos e novos, mesmo com baixa cobertura.

Métodos

Resultados

Numa família japonesa de quatro gerações afetada por BAFME, uma variante estrutural heterozigótica (SV) em SAMD12 Uma região de repetição intrónica foi identificada no indivíduo afetado, consistente com estudos anteriores. O tamanho da expansão da repetição foi semelhante entre os indivíduos após a passagem da linha germinativa paterna. O sequenciamento PacBio SMRT conseguiu cobrir totalmente o comprimento da repetição de 4 kb observado. O sequenciamento de genoma completo (WGS) de longas leituras utilizando o sistema Pacbio Sequel revelou numerosas inserções e deleções, incluindo seis SVs específicos para o indivíduo afetado na região ligada ao BAFME1. Uma inserção notável de 4661 bp foi identificada entre sequências repetitivas AluSq2 e (TAAAA)n. A análise mostrou que esta inserção compreendia uma sequência nova em vez de uma duplicação em tandem, com uma alta proporção de sequências de baixa complexidade.

Fig 1. Pedigree de uma família com variação estrutural patogénica de SAMD12.

Fig. 2. Avaliação do WGS de longa leitura.

Conclusão

A sequenciação de leitura longa agora lê DNA com mais de 10 kb, permitindo a deteção de grandes variações estruturais. Os autores aplicaram a sequenciação PacBio SMRT a uma família com epilepsia mioclónica benigna familiar em adultos, identificando seis variações estruturais numa região BAFME1 de 7,16 Mb e confirmando uma variação de 4,6 kb. SAMD12 A inserção repetida é considerada causal. O sequenciamento genómico de longo alcance (WGS) promete uma análise abrangente de variantes estruturais (SV) e a descoberta de novas variantes causadoras de doenças em condições não diagnosticadas.

Referência:

1. Mizuguchi T, Toyota T, Adachi H, et al.. Detetando uma variante de inserção longa em SAMD12 por sequenciação SMRT: implicações da sequenciação do genoma completo de longas leituras para doenças de expansão de repetições. Revista de Genética Humana. 2019, 64(3):191-7.