Sequenciação do Genoma Completo de Microrganismos

Com décadas de experiência nas áreas de sequenciação do genomaA CD Genomics está dedicada a fornecer um serviço de sequenciação do genoma microbiano completo, preciso e acessível. Combinamos tanto a Illumina (leituras curtas) como Plataformas PacBio (leituras longas) para re-sequenciamento microbiano e genoma completo de novo sequenciaçãoA nossa forte experiência é aprimorada por estratégias de sequenciamento flexíveis e profissionais. bioinformática pipelines.

A Introdução do Sequenciamento do Genoma Completo Microbiano

Existem grandes diferenças entre microrganismos e eucariotos superiores. Além do seu genoma mais pequeno, a maioria das bactérias possui um único cromossoma circular (embora às vezes existam mais de um cromossoma, cromossomas lineares ou combinações de cromossomas lineares e circulares). Os genes nos genomas microbianos são geralmente uma única sequência contínua de ADN, embora vários tipos de íntrons raramente existam no genoma bacteriano. A presença de plasmídeos no genoma bacteriano é outra grande diferença. Os plasmídeos, o ADN circular extracromossómico, podem ser transferidos através da transferência horizontal de ADN, mediando a rápida evolução dos microrganismos. O vírus é um organismo infeccioso não celular que consiste num núcleo de ADN ou ARN rodeado por uma cápsula proteica.

O sequenciamento do genoma completo microbiano gera uma enorme quantidade de dados, permitindo uma avaliação abrangente de todas as características genéticas de um microorganismo isolado. Sequenciação em shotgun a estratégia é um método primário de sequenciação do genoma completo de microrganismos. Os passos de sequenciação não necessitam de mapeamento e clonagem laboriosos, o que poupa um tempo e dinheiro enormes. Além disso, sequenciação de alto rendimento permite-nos sequenciar centenas de bactérias ou vírus ao mesmo tempo com o poder do multiplexing. Na sequenciação de genoma completo por shotgun, o genoma completo é dividido em pequenos fragmentos para sequenciação, e depois montado por métodos computacionais com base nas regiões sobrepostas, não necessitando, portanto, de um genoma de referência. Tecnologia SMRT da PacBio permite-nos fornecer bacteriano de novo sequenciação do genoma completo e fúngico de novo sequenciação do genoma completo que geram sequências mais precisas e contíguas.

O sequenciamento do genoma completo microbiano é crucial para a identificação microbiana precisa, a geração de genomas de referência completos.de novo sequenciação), estudos genómicos comparativos (re-sequenciação) e exploração genómica. Estudos genómicos comparativos podem identificar variações genéticas individuais e variações estruturais em grande escala dentro de uma população para a qual um genoma de referência está disponível. Características evolutivas e relações filogenéticas podem, assim, ser inferidas. A sequenciação do genoma completo de microrganismos proporciona a possibilidade de descoberta e anotação de genes. Após a explicação de múltiplos genes, novos caminhos bioquímicos que podem ser benéficos para a medicina e a biotecnologia serão provavelmente identificados.

Vantagens do Sequenciamento do Genoma Completo Microbiano

• Uma abordagem eficaz em termos de tempo e custo.
• Aplicações amplas: de novo sequenciação, anotações genéticas, estudos genómicos comparativos, estudos evolutivos de microrganismos, etc.
• Descoberta e desenvolvimento de fármacos: avaliar a contribuição do DNA na patogénese e compreender o papel dos elementos móveis na resistência a fármacos e na transmissão.

Aplicação do Sequenciamento do Genoma Completo de Microrganismos

• Identificação de Patógenos: Determinação rápida e precisa da identidade do patógeno através da comparação com bases de dados genómicos estabelecidas, facilitando diagnósticos clínicos e investigações epidemiológicas.
• Monitorização da Resistência a Antibióticos: Identificação e análise de genes de resistência para desvendar os mecanismos de resistência microbiana, fornecendo orientações para a gestão clínica e vigilância da disseminação da resistência.
• Comparações Genómicas: Análise comparativa de genomas entre diferentes estirpes para delinear variações genéticas, ajudando na compreensão da evolução microbiana, diversidade genética e dinâmicas populacionais.
• Genómica Funcional: Descoberta de genes funcionais e vias metabólicas dentro dos genomas para decifrar características biológicas microbianas e papéis ecológicos.
• Monitorização da Poluição Ambiental: Análise de sequenciamento de comunidades microbianas ambientais para monitorizar os efeitos dos poluentes e as respostas microbianas, avaliando a integridade ambiental.
• Descoberta de Fármacos: Aproveitar dados genómicos microbianos para a exploração de novos alvos terapêuticos e produtos naturais, acelerando. desenvolvimento de medicamentos e esforços de descoberta.
• Biosegurança e Controlo: Monitorização vigilante e deteção preemptiva de potenciais ameaças de bioterrorismo ou biosegurança, garantindo a segurança pública e nacional.
• Monitorização da Segurança Alimentar: Vigilância e deteção de contaminação microbiana nos alimentos para manter os padrões de segurança alimentar e proteger a saúde do consumidor.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação do Genoma Completo Microbiano

A CD Genomics pode oferecer serviços integrados de sequenciação de genomas para bactérias, leveduras, fungos, fagos e vírus. A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa uma gestão de alta qualidade seguindo cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais com o sistema Illumina HiSeq e/ou PacBio SMRT. O fluxo de trabalho geral para a sequenciação do genoma completo de microrganismos está delineado abaixo.

Especificação do Serviço

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação do Genoma Completo Microbiano para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece um pacote completo de serviços de sequenciação do genoma microbiano, incluindo padronização de amostras, construção de bibliotecas, sequenciação profunda, controlo de qualidade dos dados brutos, montagem do genoma e análise bioinformática posterior. Podemos personalizar este fluxo de trabalho de acordo com o seu interesse de investigação. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Referência:

1. Fraser C. M., et al.Sequenciação do genoma microbiano. Natureza, 2000, 406(6797): 799.

Os resultados parciais estão apresentados abaixo:

1. Como preparar amostras?

Pode submeter microrganismos cultivados puros ou amostras de ADN genómico extraído para sequenciação do genoma completo microbiano. Para microrganismos cultivados, as células purificadas devem ser centrifugadas num tubo de 1,5 mL que não contenha meio. Precisamos de um mínimo de 1 milhão de células, e quanto mais células puder oferecer, melhor. Para amostras de ADN genómico, a quantidade recomendada para submissão é de 2 µg ou mais, com uma concentração superior a 20 ng/µl. A razão de OD260/OD280 deve estar entre 1,8 e 2,0. As amostras devem ser enviadas congeladas em gelo seco.

Amostras de fezes: armazene as amostras de fezes abaixo de -80℃. Empiricamente, fezes frescas contribuem para isolar DNA preferencial.

2. Como aumentar a precisão da montagem do genoma ao utilizar o sistema PacBio SMRT?

A taxa de erro de leitura bruta de PacBio SMRT o sistema é substancialmente mais elevado, cerca de 14%, em comparação com a taxa de erro de 0,1 a 1% de outros sistemas de sequenciação líderes. No entanto, o modelo de erro é estocástico, portanto, leituras de muito alta qualidade em todas as bases podem ser alcançadas na sequência de consenso. Além disso, o Sequenciação SMRT o sistema é capaz de sequenciar regiões de alto conteúdo de GC, levando a uma cobertura muito mais uniforme do genoma.

Existem três maneiras de garantir a precisão da montagem do genoma: (i) antes da montagem, corrigir sequências na sequência de consenso; (ii) corrigir os resultados da montagem de sequências utilizando dados de sequenciação; (iii) corrigir os resultados da montagem de sequências utilizando alta qualidade. sequenciação de próxima geração dados. Após as três correções, a precisão da montagem da sequência final pode atingir 99,99%.

3. Como alcançar zero lacuna?

Atualmente, o mapa de sequência completo de mais de 90% das estirpes bacterianas pode ser construído utilizando uma combinação de Illumina HiSeq e PacBio SMRT sistemas. O mapa de sequência completo dos restantes 10% das estirpes bacterianas pode ser alcançado com Sequenciação de Sanger dados.

4. É possível alcançar uma montagem completa do genoma mesmo nas regiões de alto ou baixo conteúdo de GC, assim como em sequências repetitivas?

O sistema Pacbio RS II pode superar os desafios mencionados. A CD Genomics completou centenas de casos de montagem de genomas bacterianos sem lacunas.

5. Quais são as vantagens do sequenciamento do genoma completo de microrganismos na prática clínica?

Sequenciação do genoma completo tem sido uma ferramenta rotineira para a microbiologia clínica. Pode reduzir o tempo de diagnóstico e melhorar o controlo e tratamento. Descreve e melhora a nossa compreensão da evolução microbiana, surtos e eventos de transmissão. Os procedimentos convencionais para sequenciação do genoma completo frequentemente incluem múltiplas etapas de cultivo e incubação seguidas pela identificação de espécies, testes de suscetibilidade e tipagem, o que pode levar várias semanas. Vários outros métodos (como os baseados em PCR) são baratos e rápidos, mas limitados em termos de sensibilidade. Embora o sequenciamento do genoma completo ainda seja demasiado caro, o preço e o tempo de resposta provavelmente irão diminuir devido à concorrência entre as plataformas de sequenciamento.

Referência:

1. Hasman H., et al.Sequenciação rápida de todo o genoma para a deteção e caracterização de microrganismos diretamente a partir de amostras clínicas. Revista de Microbiologia Clínica, 2013: JCM. 02452-13.

A Sequência do Genoma da Cepa Híbrida Interespécies ISA1307 Derivada de Zygosaccharomyces bailii, Altamente Tolerante ao Ácido Acético, Isolada de uma Fábrica de Vinho Espumante

Revista: Pesquisa em DNA
Fator de impacto: 5,404
Publicado: Junho de 2014

Fundo

Este trabalho descreveu o sequenciação do genoma e anotação da estirpe de levedura ISA1307, isolada de uma planta de produção de vinho espumante. Esta estirpe, anteriormente considerada como a Zygosaccharomyces bailii espécies, é um híbrido entre espécies diferentes de Z. bailii e uma espécie intimamente relacionada.

Métodos

Resultados

1. A tensão híbrida ISA1307

A comparação das sequências dos genes de manutenção (incluindo RPB1, RPB2, EF1-α e β-tubulina) revelou que a estirpe ISA1307 é um híbrido interespecífico entre Z. bailii e uma espécie estreitamente relacionada.

2. Montagem do genoma

A quantificação por citometria de fluxo revelou que o tamanho estimado do ISA1307 é de cerca de 22,0 Mb, com S. cerevisiae BY4741 e BY4743 utilizados como curva de calibração (Figura 1A). O perfilamento PFGE do ISA1307 foi realizado, e 13 bandas cromossómicas foram observadas, com tamanhos variando de 733 a 2120 Mb (Figura 1B).

Figura 1. Estimativa do tamanho do genoma e cariotipagem da estirpe ISA1307. (A) Histograma de análise celular representativo. (B) Cariotipo da estirpe de referência Z. bailii ATCC58445 (faixa 2) e da estirpe ISA1307 (faixa 1).

O genoma final reconstruído da estirpe ISA1307 está distribuído por 154 scaffolds. A soma de todos os tamanhos dos scaffolds é de 21241152 bp, o que corresponde a 96% do tamanho do genoma que foi estimado por citometria de fluxo (Tabela 1).

3. Anotação

Um total de 9.925 genes são previstos para ser codificados pela estirpe ISA1307, incluindo 4.385 genes duplicados e 1.155 genes de cópia única. As funções previstas envolvem "metabolismo e geração de energia", "dobramento, modificação e direcionamento de proteínas" e "biogénese de componentes celulares". Os autores estudaram ainda os genes e proteínas da ISA1307 envolvidos nas funções acima mencionadas.

Figura 2. Classes funcionais de genes previstos para serem codificados pelo genoma da estirpe ISA1307.

Conclusão

Assim, foi estabelecido um conjunto de alelos de referência específicos, utilizando tecnologia de sequenciação de terceira geração, que oferece uma exploração longitudinal detalhada de loci genéticos que se estendem por vários milhares de pares de bases. Esta nova técnica complementa as técnicas de sequenciação de segunda geração ou de leitura curta, provando ser criticamente instrumental na decifração de alelos novos, raros e nulos.

Referência:

1. Mira N. P., et al.A sequência do genoma da estirpe híbrida interespecífica ISA1307, derivada de Zygosaccharomyces bailii, altamente tolerante ao ácido acético, isolada de uma fábrica de vinho espumante. Pesquisa de DNA, 2014, 21(3): 299-313.