Diretrizes para Submissão de Amostras
Por que o PacBio HiFi — Precisão que leituras curtas e outras leituras longas não conseguem igualar
Se trabalha com dados da Illumina, conhece o compromisso: alta precisão por base, mas leituras demasiado curtas para abranger repetições ou resolver isoformas. Se explorou o sequenciamento por nanopore, ganhou comprimento — mas à custa da precisão bruta. O PacBio HiFi é a única plataforma que elimina este compromisso.
O que acontece dentro de um ZMW?
A sequenciação de moléculas únicas em tempo real (SMRT) da PacBio ocorre dentro de guias de onda de modo zero — câmaras de observação em nanoscale onde uma única DNA polimerase incorpora nucleotídeos fluorescentes um de cada vez. Ao contrário da sequenciação por nanoporo (que infere bases a partir da corrente iónica) ou da Illumina (que constrói leituras a partir de aglomerados de fragmentos idênticos), a SMRT observa uma única molécula em tempo real.
A diferença HiFi: Os adaptadores SMRTbell circularizam cada molécula de ADN. A polimerase, então, lê em torno do círculo várias vezes. Estas múltiplas passagens são combinadas em uma única leitura consensual HiFi — proporcionando tanto o comprimento de uma leitura longa quanto a precisão de múltiplas observações independentes.
PacBio SMRTbell → ZMW → consenso circular → leitura HiFi com QV ≥30
Três capacidades que obtém de uma única célula SMRT.
- QV ≥30 leituras longas (~15–20 kb) — suficientemente preciso para a chamada de variantes, longo o suficiente para montagem e faseamento.
- Metilação simultânea de 5mC — a cinética da polimerase revela bases modificadas durante a mesma corrida. Sem bisulfito. Sem biblioteca separada.
- Isoformas completas sem montagem — O Iso-Seq/Kinnex captura cada transcrito desde o local de início da transcrição até à cauda poli-A como uma única leitura. A isoforma é medida, não reconstruída.
Onde o HiFi supera as alternativas
- vs leituras curtas da Illumina: Repetições de spans, SVs e isoformas completas. Monta genomas completos em vez de contigs fragmentados.
- vs leituras longas NanoporePrecisão de QV de molécula única ≥30 sem polimento. Detecção de metilação incorporada, não adaptada.
- vs a execução de múltiplos experimentosUma célula SMRT fornece variantes + metilação + isoformas. Sem fluxos de trabalho paralelos para coordenar.
Os Nossos Serviços de Sequenciação PacBio SMRT
Todos os serviços abaixo funcionam na mesma plataforma HiFi — mesma precisão, mesma capacidade de metilação, mesma qualidade de dados.
Sequenciamento de Genoma Completo de Novo
Montagem de genomas sem referência para genomas microbianos, vegetais, animais e humanos. Leituras HiFi abrangem repetições e fornecem montagens contíguas com uma completude BUSCO >90%.
Melhor para: Sequenciação de organismos novos, projetos de pan-genoma, finalização T2T.
Sequenciação do Genoma Humano Completo
WGS humanoide baseado em HiFi para deteção abrangente de variantes — SNVs, indels, SVs e haplótipos faseados a partir de um único conjunto de dados.
Melhor para: Doença rara, descoberta de SV, farmacogenómica, estudos populacionais.
Genoma completo de novo de Planta/Animal
Montagens multi-plataforma (HiFi + Hi-C + RNA-seq) para genomas complexos, incluindo poliploides e genomas grandes e repetitivos.
Melhor para: Genomas grandes, espécies poliploides, agri-genómica, biologia evolutiva.
Sequenciação de Telómero a Telómero (T2T)
Montagens em escala de cromossomas sem lacunas usando leituras HiFi + ONT ultra-longas. Captura centrómeros, telómeros e duplicações segmentares.
Melhor para: Genomas de referência, biologia do centrómero, finalização de montagem completa.
Sequenciação de Transcritos de Comprimento Completo (Iso-Seq / Kinnex)
Catálogos completos de isoformas desde o TSS até ao polyA. Resolva variantes de splicing, genes de fusão e APA — sem ambiguidade na montagem de leituras curtas.
Melhor para: Descoberta de isoformas, splicing alternativo, deteção de fusões, anotação de transcritos.
Sequenciação de Amplicões de Comprimento Total 16S/18S/ITS
Resolução taxonómica a nível de espécie com amplicões de genes rRNA de comprimento completo. Preciso a nível de estirpe onde amplicões curtos param no género.
Melhor para: Ecologia microbiana, amostras ambientais, identificação a nível de estirpe.
Sequenciação Metagenómica de Longa Leitura
Metagenómica HiFi para recuperação de MAG, anotação funcional e perfilagem de comunidades a nível de estirpe. Métodos PacBio ou Nanopore disponíveis.
Melhor para: Comunidades complexas, agrupamento MAG, descoberta de genes funcionais.
Sequenciação CiFi | Sequenciação de Biblioteca Pré-Fabricada | Análise de Longos Amplicões (LAA)
Fluxos de trabalho especializados: CiFi para análise de variantes em fases, Biblioteca Pré-Fabricada para bibliotecas SMRTbell preparadas pelo cliente, LAA para resolução de haplótipos direcionados.
Onde a PacBio HiFi Adiciona Mais Valor
Abaixo estão as áreas de investigação onde as leituras longas HiFi resolvem problemas que as leituras curtas ou as leituras longas de menor precisão não conseguem. Cada aplicação corresponde ao serviço PacBio adequado.
Montagem e finalização de genomas de novo
Repetições de span e regiões complexas para produzir montagens completas e contíguas. Combine HiFi com Hi-C para andaimes em escala de cromossomas.
Serviços recomendados: De novo WGS, Sequenciação T2T, WGS de Plantas/Animais.
Deteção de variantes estruturais e rearranjos
Identificar grandes inserções, deleções, inversões e translocações com resolução a nível de ponto de ruptura.
Serviços recomendados: WGS humano, WGS de novo.
Faseamento de haplótipos e análise específica de alelos
Leituras Longas de HiFi preservam a ligação entre variantes distantes — geram montagens resolvidas por haplótipos e chamadas de variantes.
Serviços recomendados: Sequenciação de WGS Humano, Sequenciação CiFi, LAA.
Transcriptómica de comprimento completo (isoformas e fusões)
Capture catálogos completos de isoformas desde o TSS até à cauda poli-A — sem suposições de montagem computacional.
Serviços recomendados: Sequenciação de Transcritos de Comprimento Total Iso-Seq/Kinnex.
Metilação do DNA (5mC) — simultânea com sequenciação
Perfis de 5mC em todo o genoma a partir da cinética SMRT — sem conversão a bisulfito. Uma corrida = variantes + metilação.
Serviços recomendados: Qualquer serviço de WGS (metilação extraída de dados HiFi padrão).
Microbioma e metagenómica
Sequenciamento completo de 16S/18S/ITS para taxonomia a nível de espécie. Metagenómica HiFi para recuperação de MAG e perfilagem funcional.
Serviços recomendados: Amplicon de Comprimento Total, Metagenómica de Leitura Longa.
Sequenciação direcionada e validação
Cobertura profunda de loci específicos para faseamento de variantes, análise de expansão de repetições e caracterização específica de alelos.
Serviços recomendados: LAA, Sequenciação CiFi, Biblioteca Pré-Fabricada.
Pan-genoma e genómica populacional
Construa referências pan-genómicas abrangentes com montagens HiFi que capturem SVs entre populações.
Serviços recomendados: De novo WGS, Sequenciação T2T, WGS de Plantas/Animais.
O que Receberá — Dados Preparados para Publicação
Cada projeto vem com os dados brutos, resultados processados e documentação de que precisa para passar diretamente à análise — e diretamente para o seu manuscrito.
| Categoria de Dados | O Que Você Recebe | Por Que É Importante |
|---|---|---|
| Leituras HiFi | FASTQ/BAM, QV ≥30, etiquetas de QC por leitura | Pronto para montagem, alinhamento ou chamada de variantes — nenhum passo de polimento necessário. |
| Subleituras (BAM) | Leituras de polimerase bruta com informação cinética | Permite a reanálise de metilação e o ajuste personalizado de parâmetros CCS. |
| Relatório de QC | Rendimento, comprimento de leitura N50, distribuição de pontuação Q, passes CCS, equilíbrio de código de barras | Evidência transparente de que a sua corrida cumpriu os objetivos acordados. |
| Assembleia | FASTA/GFA, N50/NG50, completude BUSCO | Genoma pronto para publicação com estatísticas que os revisores esperam |
| Variantes | VCF com SNV/indel/SV, faseado quando aplicável | Variantes em fases a partir de leituras longas — sem necessidade de imputação estatística |
| Metilação | bedMethyl/TSV, resumos de DMR, faixas em todo o genoma | Chamadas de 5mC do mesmo lote que as suas variantes — zero preparação extra. |
| Isoformas | Catálogo de isoformas GTF/GFF3, tabelas de expressão, lista de fusões | Modelos de isoformas completos, cada um suportado por leituras de comprimento total. |
| Memorando do Projeto | Protocolo, detalhes do kit/química, versões de software, parâmetros de execução | Tudo o que um revisor precisa para avaliar a sua seção de métodos. |
Como o Seu Projeto Funciona — O Fluxo de Trabalho PacBio SMRT
- Amostragem e Controlo de QualidadeQubit + espectrofotometria. gDNA: A260/280 1,8–2,0, comprimento modal ≥30 kb. RNA: RIN ≥8 para Iso-Seq.
- Preparação da Biblioteca SMRTbellLigação de adaptadores, seleção de tamanho por aplicação. Concatenação Kinnex para Iso-Seq multiplexado. Adaptadores com código de barras para agrupamento de amostras.
- Sequenciação de Células SMRTSistemas Sequel II/IIe ou Revio. Tempos de execução de 10 a 30 horas, dependendo do rendimento alvo e do tipo de SMRT Cell (8M ou 25M).
- CCS → Geração HiFiAs subleituras de cada ZMW são processadas através do algoritmo CCS. Leituras HiFi requerem ≥3 passagens completas e atendem ao limiar QV ≥30.
- Análise e QC: Montagem, chamada de variantes, deteção de metilação ou análise de isoformas conforme o serviço selecionado. QC pós-análise com taxa de mapeamento e métricas de cobertura.
- EntregaPastas de dados estruturados, memorando completo do projeto, relatório de QC e apresentação opcional dos resultados com a nossa equipa de bioinformática.
Requisitos de Amostra
| Serviço | Quantidade e Integridade | Pureza | Envio | Notas |
|---|---|---|---|---|
| WGS (Microbiano) | ≥1 μg gDNA, ≥30 kb | A260/280 1.8–2.0 | −20 °C | — |
| WGS (Planta/Animal) | ≥3–5 μg gDNA HMW, ≥30 kb | A260/280 1,8–2,0; A260/230 ≥2,0 | −20 °C | Dicas de grande diâmetro, sem vórtices |
| WGS (Humano) | ≥1–3 μg gDNA, ≥30 kb | A260/280 1,8–2,0 | −20 °C | — |
| Genoma T2T | ≥3–5 μg gDNA HMW, ≥50 kb | A260/280 1.8–2.0 | −20 °C | Minimizar todos os cortes. |
| Iso-Seq / Kinnex | ≥500 ng–1 μg de RNA total, RIN ≥8 | A260/280 ~2.0; A260/230 ≥2.0 | −80 °C (gelo seco) | DNase se necessário |
| Amplicão 16S/18S/ITS | ≥50–200 ng de amplicões agrupados | Sem dímeros de primers | 4 °C | Fornecer informações básicas |
| Metagenómica | ≥500 ng–1 μg gDNA | A260/280 1,8–2,0 | −20 °C | Nota de esgotamento de anfitriões |
| CiFi / LAA | ≥1–2 μg gDNA HMW / ≥100 ng amplicões | Por aplicação | −20 °C / 4 °C | Fornecer regiões-alvo |
| Biblioteca Pré-Fabricada | ≥50 ng biblioteca SMRTbell | Relatório de QC necessário | −20 °C | Fazemos controlo de qualidade à chegada. |
- GeralEvite fenol, heparina, EDTA, polissacarídeos. Minimize ciclos de congelamento-descongelamento. Contacte-nos para amostras FFPE ou de baixo input.
Bioinformática — Dos HiFi Reads à Perspectiva Biológica
Todos os projetos incluem bioinformática padrão. Análises avançadas são adaptadas à sua questão de investigação específica.
- CCS e DemultiplexagemSubleitura → Geração HiFi com filtragem QV. Demultiplexação por amostra com QC de código de barras.
- Montagem De Novohifiasm ou hicanu para montagens a nível de contíguos. Avaliação de completude BUSCO. Escoramento Hi-C opcional para montagens a escala de cromossomos.
- Chamadas de VariantesDeepVariant / pbsv para SNV/indel/SV. Faseamento baseado em Whatshap utilizando leituras HiFi para VCFs resolvidos por haplótipos.
- Metilação 5mCferramentas pb-CpG para chamada de 5mC por local. Detecção de DMR. Análise de metilação específica de motivos. Faixas em todo o genoma.
- Análise de IsoformasPipeline Iso-Seq para descoberta de isoformas, quantificação, deteção de fusões e poliadenilação alternativa.
- MetagenómicaClassificação taxonómica, agrupamento de MAG, anotação funcional (KEGG, COG, CAZy).
Qualidade e Desenho do Estudo
- Replicados≥2 réplicas biológicas por condição. Padrões de spike-in disponíveis para quantificação.
- Cobertura30–60× HiFi para montagem de novo. Modelagem de cobertura personalizada para deteção de variantes e Iso-Seq com base nos seus alvos.
- Portões de QCrendimento HiFi, leitura de polimerase N50, contagem de passes CCS e fração em alvo — tudo acordado antes do início da sua corrida.
- Qualidade do DNA: HMW gDNA comprimento modal ≥30 kb. Verificamos a integridade antes da preparação da biblioteca e alertamos se a amostra de entrada ficar abaixo do limiar.
PacBio HiFi vs Nanopore vs Illumina
Escolher a plataforma certa para o seu projeto? Aqui está como elas se comparam nas dimensões que importam para os resultados da pesquisa.
| O que Importa | PacBio HiFi | Nanopore (ONT) | Illumina |
|---|---|---|---|
| Precisão de leitura (molécula única) | QV ≥30 (≥99,9%) | Melhorando; dependente da profundidade | ≥99,9% |
| Comprimento de leitura | ~15–20 kb HiFi; subleituras mais longas | Até classe Mb | 2×300 pb máx |
| Deteção de metilação | 5mC da cinética — mesma corrida, sem bisulfito | 5mC/6mA do sinal; RNA direto | Não nativo |
| Resolução de isoformas | Leituras completas, sem necessidade de montagem | Comprimento total, mas precisão de base inferior. | Dependente de montagem (fragmentado) |
| Melhor caso de uso | Assemblagens + variantes + metilação a partir de um conjunto de dados | Vão ultra-longo; trabalho sensível ao tempo ou de campo | Cohortes de SNV/indel profundas |
Guia de decisão rápida
- Necessita da mais alta precisão em leituras longas. para montagens e variantes: escolher PacBio HiFi.
- Preciso das moléculas mais longas. (telómeros, repetições massivas): adicionar Nanopore Ultra-Long.
- Necessita de metilação + variantes de um experimento.: PacBio HiFi — sem bisulfito, sem preparação extra.
- Grandes coortes de SNV/indel: Illumina para profundidade; adicionar HiFi para SVs e faseamento.
- Designs híbridosHiFi + leitura curta ou HiFi + ONT equilibra precisão, completude e custo.
O desempenho real depende da qualidade da amostra, preparação da biblioteca, profundidade de sequenciação e pipeline de análise.
Por que a CD Genomics para Sequenciação PacBio SMRT?
Tem opções de prestadores de serviços PacBio. Aqui está o que fazemos de diferente.
- Uma corrida, mais dadosOs nossos fluxos de trabalho HiFi são projetados para maximizar o que você obtém de cada célula SMRT — variantes, metilação e métricas de montagem a partir de um único experimento.
- QC que pode publicar: Cada projeto inclui um relatório de QC detalhado com métricas que os revisores esperam. Sem caixas pretas.
- Análise que corresponde à sua perguntaNós adaptamos a bioinformática aos seus objetivos de pesquisa — não uma abordagem única para todos.
- Orientação multiplataformaQuando o HiFi sozinho não é o ideal, nós informá-lo-emos — e sugeriremos um design híbrido que lhe poupa dinheiro e tempo.
- Orientado por SOP, não ad-hocCada passo — recepção, preparação da biblioteca, sequenciação, CCS, análise — segue um SOP documentado com critérios de aceitação definidos.
- Apoio à publicaçãoPrecisa de ajuda com um parágrafo de métodos, preparação de figuras ou resposta a revisores? Já fizemos isso antes.
- Sem bloqueio de instrumentoExecutamos sistemas PacBio Sequel II/IIe e Revio. Você obtém o formato de SMRT Cell adequado para o tamanho do seu projeto — 8M ou 25M.
Resultados da Demonstração
Distribuição do Q-Score HiFi Read — mediana QV ≥30 em todas as passagens
Distribuição do Comprimento de Leitura HiFi — N50 tipicamente 15–20 kb por Célula SMRT
Métricas de Montagem De Novo — N50 de contig, N50 de scaffold e completude BUSCO
Perguntas Frequentes sobre Sequenciação SMRT da PacBio
1. O que torna o PacBio HiFi diferente de outras sequências de leitura longa?
HiFi é a única tecnologia de leitura longa que fornece uma precisão de QV ≥30 a nível de molécula única. Isso é alcançado através da sequenciação de consenso circular — cada molécula é lida várias vezes e as leituras são combinadas. Em contraste, as leituras brutas de nanopore têm uma precisão por base inferior e normalmente requerem etapas de consenso ou polimento. O HiFi também deteta a metilação 5mC a partir da cinética da polimerase na mesma corrida, sem necessidade de química adicional.
2. Como é que a precisão do HiFi se compara à da Illumina?
As leituras HiFi correspondem à precisão por base da Illumina (≥99,9%) enquanto são 50–100× mais longas. Isso significa que pode identificar SNVs com a mesma confiança que as leituras curtas — mas também detectar variantes estruturais, fasear haplótipos e montar genomas sem lacunas. HiFi não é um compromisso entre precisão e comprimento; oferece ambos.
3. Posso detetar a metilação a partir da minha corrida PacBio?
Sim — e não precisa fazer nada extra. As polimerases PacBio desaceleram em bases metiladas, produzindo assinaturas cinéticas que o basecaller interpreta como chamadas de 5mC. Estas chamadas são geradas durante a análise CCS padrão. Sem conversão de bisulfito, sem biblioteca separada, sem corrida de sequenciação paralela. Você obtém variantes e metilação de uma única célula SMRT.
4. O que é Iso-Seq e quando devo usá-lo em vez de RNA-seq de leituras curtas?
Iso-Seq (agora também disponível como Kinnex para maior rendimento) sequencia moléculas de cDNA de comprimento completo desde o local de início da transcrição até a cauda poli-A em leituras únicas. Utilize-o quando precisar identificar estruturas de isoformas completas, detectar transcritos de fusão ou quantificar o uso de isoformas — tarefas em que a RNA-seq de leituras curtas faz suposições sobre a montagem de isoformas. O Kinnex concatena múltiplos transcritos por leitura, aumentando o rendimento por célula SMRT em cerca de 5 vezes.
5. Quanto DNA eu preciso?
WGS padrão: ≥1–5 μg de gDNA HMW com comprimento modal ≥30 kb. Projetos T2T: ≥3–5 μg com ≥50 kb. Iso-Seq: ≥500 ng–1 μg de RNA total com RIN ≥8. Entradas mais baixas podem ser possíveis — entre em contacto connosco com as suas limitações de amostra.
6. Quanto tempo demora um projeto?
Os prazos dos projetos dependem da preparação da biblioteca, da configuração de sequenciação e do âmbito da bioinformática. Fornecemos um cronograma detalhado durante a consulta do projeto com base nas suas necessidades específicas.
7. Que instrumentos você usa?
Sistemas PacBio Sequel II/IIe e Revio, formatos SMRT Cell 8M e 25M. Todas as corridas são monitorizadas por técnicos experientes com portões de QC baseados em SOP.
8. Posso enviar as minhas próprias bibliotecas SMRTbell?
Sim. O nosso serviço de Sequenciamento de Bibliotecas Pré-Fabricadas aceita bibliotecas preparadas pelos clientes. Fazemos o controlo de qualidade à chegada, carregamos na SMRT Cell apropriada e entregamos dados CCS, além de bioinformática opcional.
9. Como é que isto é diferente dos serviços da PacBio que posso obter em outros lugares?
Três diferenças: (1) Otimizamos cada Célula SMRT para múltiplos tipos de dados — você obtém variantes E metilação E métricas de montagem na mesma corrida. (2) Cada projeto inclui um relatório de QC pronto para publicação com métricas que os revisores esperam. (3) Fornecemos orientação entre plataformas — se um design híbrido HiFi + ONT ou HiFi + Illumina servir melhor à sua questão, nós o recomendaremos.
Estudo de Caso — Análise de Resolução de Isoformas da Degradação de mRNA Mediado por Nonsense
Pesquisa Publicada
Descobrindo a paisagem cinética de resolução de isoformas da degradação de mRNA mediada por nonsense com EZbakR
Métodos: PacBio Iso-Seq | Publicado: 2025 | PMC11952489
Fundo
A degradação de mRNA mediada por nonsense (NMD) é uma via de controlo de qualidade que elimina mRNAs com códon de terminação prematuro. Embora os alvos de NMD a nível de massa sejam conhecidos, a dinâmica de NMD a nível de isoforma — quais variantes de splicing específicas são alvo e quão rapidamente decaem — permanece pouco compreendida porque o RNA-seq de leituras curtas não consegue resolver isoformas de comprimento completo.
Materiais e Métodos
Desenho Experimental
- Rotulagem metabólica (EZbakR)
- Amostragem ao longo do tempo
- Replicados biológicos
Sequenciação
- PacBio Iso-Seq
- cDNA de comprimento completo
- Concatenação Kinnex
Análise
- Descoberta de isoformas
- Modelagem cinética
- Taxas de decaimento diferenciais
Resultados
- Alvo de NMD específico para isoformas
- Um único gene produz isoformas sensíveis e resistentes ao NMD, dependendo do splicing alternativo.
- A modelagem cinética com resolução de isoformas revelou uma hierarquia de taxas de degradação invisível aos métodos de RNA-seq em massa.
- Paisagem cinética da NMD
- Quantificação da taxa de decaimento específica do transcrito
- EZbakR + Iso-Seq permitiu a medição direta das meias-vidas dos isoformas.
- Identificou mecanismos de escape da NMD ao nível da isoforma que não podem ser detetados por análise ao nível do gene.
Conclusão
Este estudo demonstra que o Iso-Seq de comprimento total da PacBio permite estudos cinéticos com resolução de isoformas que são impossíveis com RNA-seq de leituras curtas. Para os investigadores que estudam o splicing alternativo, a regulação pós-transcricional ou a expressão génica ao nível das isoformas, o Iso-Seq fornece a resolução molecular para fazer perguntas mecanicistas — e obter respostas ao nível de isoformas de transcritos individuais.
Referência
- Descobrindo a paisagem cinética de resolução de isoformas da degradação de mRNA mediada por nonsense com o EZbakR. PMC11952489, 2025. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. No entanto, posso ajudar a traduzir texto que você fornecer. Por favor, cole o texto que deseja traduzir.
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A primeira montagem e anotação de genoma de alta qualidade de Lantana camara, uma planta ornamental importante e uma espécie invasora significativa.
Revista: Avanços em Horticultura
Ano: 2024
DOI: 10.1007/s44281-024-00043-6
Sequência Genómica Completa do Actinobactéria Degradadora de Lignocelulose Streptomyces albus CAS922
Revista: Anúncios de Recursos em Microbiologia
Ano: 2020
DOI: 10.1128/mra.00227-20
Uma montagem de genoma em escala de cromossoma e resolvida por haplótipos de amora-tetraploide (Rubus L. subgênero Rubus)
Revista: Pesquisa em Horticultura
Ano: 2025
DOI: 10.1093/hr/uhaf052
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