Sequenciação SMRT da PacBio

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Soluções de Sequenciamento SMRT da PacBio

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A CD Genomics está a fornecer sequenciação PacBio SMRT para complementar a nossa instalação de NGS. Ao tirar partido do sequenciação de moléculas únicas e leituras longas capacidade desenvolvida pela PacBio, temos o orgulho de oferecer genoma avançado de novo soluções de montagem e sequenciação de genes/transcritos de comprimento completo estratégia para atender às necessidades do seu projeto.

Introdução ao Sequenciamento SMRT da PacBio

A sequenciação de moléculas únicas em tempo real (SMRT) utiliza uma célula de fluxo especializada com milhares de poços individuais de picolitros com fundos transparentes — guias de onda de modo zero (ZMW). A polimerase está fixada ao fundo do poço e permite que a cadeia de DNA progrida através do ZMW. Como resultado, o sistema pode focar numa única molécula. A sequenciação SMRT permite a imagem em tempo real de nucleotídeos marcados com fluorescência que são sintetizados juntamente com moléculas de template de DNA individuais. A reação de sequenciação termina quando o template e a polimerase se dissociam. O comprimento médio de leitura do instrumento PacBio é de aproximadamente 2 kb, e algumas leituras podem ultrapassar 20 kb. Leituras mais longas são especialmente úteis para de novo assemblagens de genomas novos que podem abranger muitos mais repetições e bases.

Elementos altamente repetitivos encontrados em genomas eucarióticos e procarióticos representam um desafio para a montagem do genoma e dificultam o estudo detalhado de sequências repetitivas. Sequenciação de leitura longa entrega leituras que excedem várias ou dezenas de quilobases (kbs), que podem abranger regiões complexas ou repetitivas com uma única leitura contínua, permitindo a resolução dessas grandes características estruturais. Além de sequências de DNA consideravelmente mais longas e altamente precisas de moléculas individuais não amplificadas, também pode mostrar onde ocorrem bases metiladas, fornecendo assim informações funcionais sobre as metiltransferases de DNA codificadas pelo genoma. A sequenciação PacBio SMRT tem vantagens únicas em estudos de de novo genómica, metagenómica, transcriptómica e epigenética.

Vantagens do Nosso Serviço de Sequenciação PacBio SMRT

• Maiores comprimentos médios de leitura
• Maior precisão de consenso
• Cobertura uniforme
• Caracterização epigenética simultânea
• Resolução a nível de molécula única
• Rápido e acessível

Aplicação da Sequenciação SMRT da PacBio

• Alta qualidade de novo montagem do genoma: a vantagem dos long-reads da PacBio torna-a a tecnologia principal para alta qualidade de novo montagem do genoma. As suas leituras longas contíguas ajudam a superar desafios como regiões repetitivas, viés de composição de bases e rearranjos estruturais no genoma.
• Exploração de regiões genómicas: O sequenciamento PacBio pode ajudar na exploração de regiões genómicas que anteriormente eram difíceis de sequenciar devido a longas sequências repetitivas, forte viés na composição de bases ou rearranjos estruturais.
• Sequenciação de transcritos Iso-SeqA tecnologia Iso-Seq da PacBio é utilizada para analisar transcritos de mRNA de comprimento completo sem montagem. Isso ajuda a obter informações sobre o panorama da expressão génica, particularmente para rearranjos complexos de transcritos.
• Sequenciação de longos amplicons: A sequenciação PacBio pode ser utilizada para sequenciar longos amplicons, adequada para a deteção de longos fragmentos de DNA, como amplicons de genes de comprimento total e rearranjos genómicos.
• Estudos de modificação de bases de DNA bacteriano: A tecnologia de sequenciação PacBio pode ser utilizada para estudar as modificações de bases de DNA bacteriano, como a N6-metiladenina (m6A) e a N4-metilcitosina (m4C), para compreender os seus impactos em processos como a expressão génica, o silenciamento génico e a replicação do DNA.
• Epigenómico Estudos: A tecnologia de sequenciação PacBio SMRT (Sequenciação de Molécula Única em Tempo Real) apresenta um valor de aplicação único no campo da epigenómica, através da sua capacidade de sequenciar com precisão as modificações de metilação do DNA diretamente, sem conversão por bisulfito. Isto tem um potencial significativo para esclarecer direções para estudos nesta disciplina, explorando assim os mistérios de processos celulares complexos.
• Diversidade e Pesquisa Funcional em Comunidades Microbianas: O sequenciamento PacBio SMRT oferece soluções para os desafios no sequenciamento de genomas completos de patógenos e na identificação taxonómica de microrganismos difíceis de cultivar. A sua capacidade para sequenciamento de leituras longas permite uma vigilância genómica abrangente de comunidades microbianas, proporcionando assim informações cruciais sobre a sua diversidade e papéis funcionais em vários ecossistemas.

Os nossos serviços de sequenciação SMRT da PacBio

Utilizamos os avançados instrumentos PacBio SMRT (PacBio SR II e PacBio Sequel) para vários fins de investigação, incluindo o genoma completo. de novo montagem de genoma, sequenciação de alvos de comprimento total, estudos de metagenómica, sequenciação de transcritos de comprimento total e análise de modificação de DNA em todo o genoma. A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade após cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais.

• Sequenciação metagenómica de leitura longa

  • Metagenómica, define-se como a análise genética direta de genomas contidos numa amostra ambiental. Este campo foi inicialmente lançado com a clonagem de ADN ambiental, seguido por triagens de expressão funcional e rapidamente reforçado pelo sequenciamento de ADN ambiental. O sequenciamento metagenómico de leituras longas, realizado por plataformas como o PacBio SMRT, permite a análise genética direta de diversas comunidades microbianas extraídas de várias amostras ambientais. Esta tecnologia facilita a geração de comprimentos de leitura mais longos, superando assim os elementos repetitivos observados nos genomas bacterianos. Consequentemente, oferece uma visão abrangente das funcionalidades microbianas, vias metabólicas e das relações integrais que mantêm com os seus habitats.

    As aplicações do sequenciamento metagenómico de leituras longas são amplas e robustas, abrangendo diversos campos como a ciência ambiental, biologia médica, agricultura e biotecnologia. Estas aplicações oferecem profundas oportunidades para compreender a diversidade inerente às comunidades microbianas, a dinâmica dos ecossistemas, os mecanismos das doenças e o processo de bioprospeção. Em conclusão, a tecnologia PacBio SMRT serve como uma ferramenta influente e poderosa para acelerar o progresso da investigação e as aplicações práticas em uma miríade de campos académicos e industriais. A potência desta tecnologia continuará a ser expandida e refinada nos anos vindouros.

• Genoma completo bacteriano de novo sequenciação

  • Genoma completo bacteriano de novo a sequenciação implica a reconstrução abrangente do plano genético de uma bactéria, sem depender de um genoma de referência. Esta metodologia proporciona uma compreensão mais subtil da variabilidade genética bacteriana, das dinâmicas evolutivas e dos componentes funcionais, abrangendo genes fundamentais implicados na virulência, resistência a antimicrobianos e respostas adaptativas a estímulos ambientais. O espectro de aplicações para o genoma completo de bactérias de novo a sequenciação abrange diversos domínios, desde a microbiologia clínica, onde facilita o diagnóstico rápido e a vigilância de doenças infecciosas e epidemias, até à microbiologia ambiental, permitindo a exploração aprofundada de consórcios microbianos e a sua interação ecológica.

    A sequenciação de moléculas únicas em tempo real (SMRT) pode gerar comprimentos de leitura longos (média >15.000 pb, com algumas sequências a ultrapassar 100.000 pb) e possui a maior consistência e precisão. Isto torna a sequenciação SMRT notavelmente útil para de novo montagem do genoma. Uma das principais vantagens dos longos comprimentos de leitura da SMRT é a capacidade de superar obstáculos frequentemente encontrados na pesquisa genómica, como o viés de GC e altas taxas de replicação em genomas bacterianos. Consequentemente, a sequenciação SMRT resulta frequentemente na montagem de genomas bacterianos em contigs únicos, contornando regiões de ambiguidade e as múltiplas possibilidades resultantes que podem complicar o processo de montagem.

• Genoma completo de fungos de novo sequenciação

  • Os fungos ocupam um nicho fundamental dentro da biosfera, exercendo impactos profundos tanto no equilíbrio ecológico como nos assuntos humanos, devido às suas significativas ramificações médicas e económicas. Desvendar o genoma completo dos fungos estabelece uma base sólida para investigações micológicas, promovendo uma compreensão mais profunda da biodiversidade fúngica, dinâmicas de crescimento, requisitos nutricionais, atributos fisiológicos, fundamentos genéticos, vias metabólicas e papéis ecológicos. O genoma completo dos fungos de novo O sequenciamento envolve a decifração meticulosa de todo o repertório genético de um fungo, independentemente de qualquer genoma de referência. Esta abordagem fornece perspetivas holísticas sobre a genómica fúngica, trajetórias evolutivas e atributos funcionais, abrangendo genes implicados na patogénese, adaptabilidade ambiental e biossíntese de metabolitos secundários.

    Através da utilização de leituras longas obtidas através da sequenciação de Molécula Única em Tempo Real (SMRT) no sistema PacBio, podemos gerar abrangente de novo montagens para genomas fúngicos. Estas montagens aproximam-se ou atingem zero lacunas ou erros baseados em N, com um N50 de contig >1 Mb e um elevado grau de precisão de 99,999%. Esta técnica inovadora representa um avanço significativo na melhoria dos estudos sobre genomas fúngicos.

• Sequenciação de transcritos completos (Iso-Seq)

  • A sequenciação de transcritos de comprimento total (Iso-Seq) está na vanguarda das técnicas de biologia molecular, transformando a nossa compreensão da expressão genética. Em contraste com a convencional Sequenciação de RNA métodos, propensos a gerar sequências fragmentadas, o Iso-Seq captura transcritos completos desde a iniciação até a terminação. Esta capacidade permite a identificação e quantificação precisas de isoformas alternativamente spliced e transcritos raros, apresentando uma representação holística do panorama do transcriptoma.

    Através da revelação de estruturas completas de transcritos, o Iso-Seq facilita a descoberta de novos genes, isoformas e RNAs não codificantes, desvendando territórios anteriormente inexplorados da regulação e função gênica. As suas aplicações versáteis abrangem diversos domínios, incluindo biologia do desenvolvimento, investigação do câncer e neurociência, fornecendo insights indispensáveis sobre os intrincados mecanismos que orquestram os processos celulares.

    Em comparação com a plataforma Illumina, as análises PacBio são capazes de detectar facilmente moléculas de RNA multi-exónicas extremamente longas, denominadas transcritos complexos, e expõem várias sobreposições transcripcionais novas entre genes adjacentes paralelos e distantes. Este desenvolvimento ajuda a aumentar o potencial para investigar o controlo integrado da expressão génica e da replicação em toda a rede genómica.

• Sequenciação do Genoma Humano Completo por PacBio SMRT

  • Nos dias 15 e 16 de fevereiro de 2001, as revistas Nature e Science publicaram, respetivamente, os dados de sequência abrangentes compilados pelo Projeto Genoma Humano e pelo Projeto Celera Genomics. O sequenciamento do genoma humano denota o elaborado processo de mapeamento de todas as sequências de ADN dentro do genoma humano. O objetivo deste empreendimento é decifrar os componentes, a estrutura e a funcionalidade incorporados no genoma humano, além de desvendar correlações entre os genes humanos, a saúde e a doença.

    O Sequenciamento do Genoma Humano por PacBio SMRT é um método de genómica de ponta, proporcionando profundas percepções sobre a natureza intricada do genoma humano. Impulsionado pela tecnologia de sequenciamento de Molécula Única em Tempo Real (SMRT) da PacBio, esta abordagem avançada produz leituras longas e precisas, garantindo uma exploração minuciosa de segmentos genómicos com a máxima precisão. Com a sua capacidade de capturar variações estruturais, sequências repetitivas e regiões genómicas complexas com notável detalhe, o sequenciamento PacBio SMRT capacita os investigadores a desvendar a diversidade genética, padrões evolutivos e mecanismos de doenças a um nível sem precedentes. O seu amplo espectro de aplicações abrange diversos domínios de investigação, incluindo genética populacional, medicina personalizada e diagnóstico de doenças, promovendo assim descobertas inovadoras na biologia humana e na saúde.

• Sequenciação de Amplicons de 16S/18S/ITS de Comprimento Total

  • Dada a evolução da tecnologia de sequenciadores, Sequenciação do gene rRNA 16S/18S/ITS tornou-se a ferramenta ideal para o estudo da taxonomia bacteriana e fúngica e da evolução molecular. Ao contrário dos métodos de sequenciação de leituras curtas convencionais, que produzem sequências fragmentadas dos genes-alvo, a sequenciação de amplicões de comprimento total captura o comprimento total das regiões 16S, 18S ou ITS. Oferecendo uma representação mais precisa da diversidade microbiana, permite uma categorização taxonómica precisa e a identificação de espécies. Ao garantir sequências completas de amplicões, os investigadores podem aprofundar-se na ecologia microbiana, evolução e interações dentro de ecossistemas complexos. Além disso, a sequenciação de amplicões de comprimento total promove a descoberta de novos táxons e genes funcionais, avançando assim a nossa compreensão das comunidades microbianas e do seu papel em diversos ambientes.

• Análise de Amplicão Longo (AAL)

  • A Análise de Longos Amplicões (LAA) utiliza PCR e Sequenciação em Tempo Real de Molécula Única (SMRT) para produzir sequências de DNA altamente precisas, em fase e de comprimento total. Essencial para sequenciação de histocompatibilidade e complementação de genes, a LAA é especialmente valiosa em estudos imunológicos do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC). Com mais de 99,9% de precisão de leitura de molécula única a partir de Sequências de Consenso Circular (CCSs) da PacBio, a LAA suporta Tipagem HLA, haplotipagem alternativa e localizado de novo assemblagens de genes alvo.

Requisitos de amostra

Pipeline de Análise

O nosso pipeline de bioinformática inclui de novo montagem, deteção de modificação de base, geração de consenso de molécula única, análise de transcritos, análise de amplicões, alinhamento de sequências com deteção de variantes. E mais mineração de dados está disponível com base nas suas necessidades específicas.

Apoiado pelos nossos cientistas experientes e plataformas avançadas, a CD Genomics pode ajudá-lo nos estudos sobre genómica, transcriptómica, epigenómica, e genómica microbiana. com comprimentos de leitura incomparáveis, cobertura uniforme e alta precisão. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Referências:

1. Site da PacBio
2. Rhoads A, Au K F. Sequenciação PacBio e as suas aplicações. Genómica, Proteómica e Bioinformática, 2015, 13(5): 278-289.

1. Quais são as diferenças entre o PacBio RS II e o PacBio Sequel?

O sistema RS II foi lançado pela PacBio em 2013, baseado na tecnologia SMRT, da qual o comprimento médio de leitura atinge 10 kb, com a mais longa a ultrapassar 20 kb. O Sequel é a mais recente plataforma da PacBio, que também se baseia na tecnologia SMRT, mas apresenta um grande aumento na capacidade de produção e na qualidade dos dados.

Tabela 1. A comparação entre PacBio RS II e Sequel.

2. O que é seleção de tamanho?

A PacBio permite o sequenciamento de bibliotecas de cDNA de comprimento total com resolução de molécula única. No entanto, a maioria dos transcritos tem entre 1-1,5 kb. Transcritos mais longos são difíceis de detectar devido à baixa abundância, viés de amplificação e carregamento preferencial de construções SMRTbell menores. Portanto, a seleção de tamanho é uma maneira poderosa de aumentar dramaticamente o número de transcritos >1,5 kb. Isso é especialmente essencial para transcritos >3 kb. Quanto a amostras degradadas, a fragmentação não é necessária, o que pode reduzir ainda mais o tamanho do inserto da biblioteca, e a seleção de tamanho é importante para remover fragmentos mais curtos que serão muito menos benéficos na montagem. A seleção de tamanho pode ser realizada com géis de agarose ou com o sistema BluePippin. Além disso, a seleção de tamanho pode ser utilizada para genoma completo de novo sequenciação.

3. Os requisitos das amostras de ADN.

Em geral, as seguintes precauções devem ser tomadas ao submeter amostras de ADN:

• Assegure-se da purificação e integridade das amostras de DNA.
• Evite a desidratação excessiva do DNA.
• Evite a visualização com etídio/UV ao usar purificação em gel.
• Evite o sobreaquecimento e a formação de vórtices no DNA.
• Submeter-se a um mínimo de ciclos de congelamento-descongelamento.
• DNA de cadeia dupla.

Tabela 2. O rendimento estimado e as quantidades recomendadas de amostras de ADN.

4. Os requisitos para amostras de RNA.

Por favor, forneça amostras de RNA integradas e purificadas (RNA ≥ 5 µg; concentração ≥ 300 ng/µl) para sequenciação de transcritos completos.

Utilizando sequenciação PacBio para investigar os efeitos do tratamento com bactérias lácticas ou antibióticos na endometrite em vacas.

Revista: Microbioma

Fator de impacto: 16,837

Publicado: 22 de janeiro de 2021

Fundos

Este artigo investiga as diversidades intra-linhagem dos assemblages de bacterioplâncton pelágico em 11 lagos de água doce profundos no Japão e na Europa. Apesar da natureza cosmopolita das linhagens de bacterioplâncton em ecossistemas de água doce, a sua microdiversidade e filogeografia permanecem pouco claras. O estudo utiliza sequenciação de amplicões de leitura longa, visando quase genes de rRNA 16S de comprimento completo e sequências de espaçadores internos transcritos ribossomais adjacentes para abordar estas lacunas na compreensão.

Métodos

Resultados

1. Desempenho e limitações metodológicas

O estudo avalia o desempenho e as limitações das plataformas de sequenciação de longas leituras, focando na precisão das leituras, rendimento e discrepâncias na composição da comunidade. Atingir sequências do gene 16S rRNA e ITS, excluindo o gene adjacente 23S rRNA, ajuda a manter a precisão das leituras. A validação utilizando SNPs identificados a partir de ASVs e mapeamento de leituras metagenómicas demonstra alta reprodutibilidade. No entanto, o baixo rendimento das leituras prejudica o desempenho da análise, limitando as leituras atribuídas a ASVs e dificultando as estimativas de diversidade alfa. A especificidade dos primers e a conectividade do operão do gene rRNA contribuem para as discrepâncias na composição da comunidade em comparação com a sequenciação de leituras curtas. Apesar das limitações, a sequenciação de amplicons de longas leituras mostra potencial para perfis filogenéticos de alta resolução de assemblages microbianas ambientais.

Figura 1. Comparação dos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) esperados com base nas variantes de sequência de amplicon (ASVs) e aqueles detectados através do mapeamento de leituras metagenómicas das sequências CL500-11 do Lago Biwa.

Figura 2. Ilustração esquemática das incompatibilidades e lacunas encontradas nos genes 16S rRNA e nas sequências do espaçador interno transcrito (ITS) da linhagem CL500-11.

2. Composição filogenética de amplicões de leitura longa

A análise identificou 742 ASVs, revelando populações diversas dentro de linhagens com alta identidade de sequência. Os filos dominantes variaram entre amostras de epilimnion e hipolimnion. Uma análise adicional focou em 11 OTUs denominadas "linhagens dominantes," representando 85,4% da abundância total de leituras, abrangendo Chloroflexi, Alphaproteobacteria e Actinobacteria.

3. Microdiversidade intra-linhagem e padrões filogeográficos entre lagos

O estudo investiga a microdiversidade intra-linhagem e os padrões filogeográficos entre comunidades de plâncton bacteriano em lagos de água doce. Ao analisar sequências de genes 16S rRNA quase completas, revela comunidades diversas dentro de uma alta similaridade de sequência. As linhagens dominantes exibem diferentes graus de microdiversidade, com algumas ASVs a dominarem cada amostra. A análise de clusters baseada na composição de ASVs mostra a influência da região e do ambiente na estrutura populacional. A migração entre lagos é limitada pela distância, mas fatores ambientais e deriva genética também desempenham papéis significativos. A análise temporal indica estabilidade ao longo do tempo, com ASVs dominantes partilhadas entre diferentes anos no Lago Biwa, sugerindo consistência temporal. No entanto, é necessária uma investigação mais aprofundada ao longo das estações e anos para uma compreensão abrangente.

Figura 3. Agrupamento de amostras com base na dissimilaridade de Bray–Curtis da composição de variantes de sequência de amplicon gerada pela média dos valores das 11 linhagens mais dominantes.

4. Microdiversidade e padrões filogeográficos da linhagem hipolimnética mais abundante (CL500-11)

O estudo examina a microdiversidade e os padrões filogeográficos do CL500-11, uma linhagem predominante de bacterioplâncton que habita os hipolimnios de lagos de água doce profundos. Identifica ASVs distintas que dominam os lagos japoneses e europeus, mostrando diferenciação genética no gene 16S rRNA e na região ITS entre estas populações. Surpreendentemente, a microdiversificação dentro dos lagos japoneses é limitada, desafiando suposições sobre os fatores que influenciam a diversificação das linhagens hipolimentares. A comparação com análises de metagenoma anteriores sugere um agrupamento genético regional dentro do CL500-11, mas a conectividade intercontinental é observada entre a Europa e a América do Norte. O estudo destaca a necessidade de uma exploração mais aprofundada da diversidade genética do CL500-11 em diferentes regiões e períodos de tempo.

Figura 4. Distribuição da dissimilaridade Bray–Curtis par a par para as composições de variantes de sequência de amplicon (ASV) entre os nove lagos japoneses.

Conclusão

Em conclusão, esta nova abordagem complementa a resolução limitada do sequenciamento de amplicões de leituras curtas e a sensibilidade restrita das estratégias orientadas para a montagem de metagenomas, proporcionando perspectivas mais esclarecedoras sobre os intricados processos ecológicos que governam a ubiquidade das linhagens de bacterioplâncton de água doce. No entanto, deve-se notar que o rendimento de leitura relativamente baixo do método representa um obstáculo considerável que deve ser abordado para aproveitar totalmente o seu potencial.

Referência:

1. Okazaki Y, Fujinaga S, Salcher M M, et al. Microdiversidade e diversificação filogeográfica do bacterioplâncton em sistemas de água doce pelágicos reveladas através de sequenciação de amplicões de leitura longa. Microbioma, 2021, 9: 1-15.