Sequenciação de Bisulfito Direcionada

Como um fornecedor líder de NGS serviços e parceiro da Illumina, a CD Genomics está dedicada a fornecer um portfólio de soluções para estudos epigenéticos. Caracterizada por requisitos de tamanho de amostra reduzido, alta resolução, eficiência e economia, a sequenciação bisulfito direcionada serve como uma ferramenta viável para a análise do estado de metilação de regiões genómicas específicas. Com mais de 10 anos de experiência profissional, podemos atender totalmente às suas exigências e orçamentos no estudo do metiloma.

A Introdução da Sequenciação de Bisulfito Direcionada

A metilação do DNA, que ocorre mais frequentemente nas citosinas nos locais CpG, desempenha um papel importante na expressão e regulação dos genes. A capacidade de detectar e avaliar a metilação do DNA de forma precisa e eficiente contribui para melhorar a nossa compreensão da metilação do DNA no desenvolvimento e na doença. Enquanto o sequenciamento de bisulfito de todo o genoma identifica citosinas metiladas numa escala de todo o genoma, o sequenciamento de bisulfito direcionado é uma tecnologia precisa, eficiente e económica para a análise da metilação do DNA em regiões-alvo, que pode incluir uma etapa baseada em hibridização em plataformas que contêm oligonucleotídeos pré-projetados que capturam as ilhas CpG, promotores de genes e outras regiões metiladas significativas, ou uma etapa baseada em PCR para amplificar múltiplas regiões de DNA convertidas em bisulfito numa única reação. Existem bibliotecas de captura comercialmente projetadas disponíveis com uma gama de características epigenéticas que cobrem cerca de 12% a 24% de todos os CpGs do genoma. Além disso, primers específicos são projetados para capturar a região de interesse e avaliar alterações na metilação do DNA específicas do local.

Vantagens da Sequenciação de Bisulfito Direcionada

• Padrão de metilação de DNA de resolução de base única em regiões seletivas.
• Precisão e sensibilidade melhoradas enquanto reduz o seu custo total.
• Permitindo uma melhor determinação tanto dos SNPs como dos eventos de estado de metilação.
• Proporcionar uma melhor compreensão do desenvolvimento e da doença.

Aplicação da Sequenciação Bisulfito Direcionada

• Pesquisa sobre Mecanismos de Regulação Genética
• Triagem de Marcadores de Metilação
• Validação da Metilação
• Investigação em Reprodução Animal e Vegetal
• Estudos Clínicos de Metilação em Grande Escala e Multi-Sítio

Fluxo de Trabalho de Sequenciação com Bisulfito Direcionada

A nossa equipa de especialistas altamente experientes e o rigoroso controlo de qualidade que segue cada procedimento garantem resultados abrangentes e precisos. No processo de sequenciação direcionada por bisulfito, o DNA genómico é convertido em bisulfito e amplificado em multiplex utilizando primers ou sondas especificamente desenhados e validados; os amplicões são agrupados através de codificação de barras e adaptação. As bibliotecas de amplicões são então submetidas a sequenciação nas plataformas Illumina HiSeq.

Especificações do Serviço

	Requisitos e preparação da amostra Fontes de amostras incluindo humanos, animais, plantas e microrganismos. DNA genómico: Quantidade recomendada ≥ 500 ng; Quantidade mínima: 50 ng, concentração ≥ 10 ng/µl, OD260/280 = 1,8 ~ 2,0 Célula: Quantidade Recomendada ≥ 1×106 Tecido: Quantidade Recomendada ≥ 20 mg O protocolo de preparação de amostras provavelmente inclui a extração de DNA genómico, purificação, quantificação, controlo de qualidade, etc.
	Sequenciação Plataformas Illumina HiSeq, paired-end de 150 bp Mais de 80% das bases com uma pontuação de qualidade ≥Q30 Profundidade de sequenciação > 100X
	Análise de Dados Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Estatísticas de dados brutos Alinhamento em relação ao genoma de referência Predição de locais de metilação e categorização de CG, CHG, CHH Estimativa do nível de metilação do DNA e tendência de distribuição Nível de 5mC em diferentes elementos estruturais do gene Identificação de regiões diferencialmente metiladas Anotação funcional dos genes proximais nas regiões diferencialmente metiladas Análise diferencial de metilação em múltiplas amostras

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciamento originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de Bisulfito Direcionada para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece serviços de dados de alta qualidade e análises bioinformáticas integradas para sequenciação bisulfito direcionada, incluindo conversão de bisulfito, design e validação de primers/probes, hibridização/amplificação por PCR, preparação de bibliotecas, sequenciação de DNA e análise de dados. A CD Genomics utiliza tanto arranjos de captura desenhados comercialmente como bibliotecas de captura personalizadas para atender plenamente aos seus objetivos de pesquisa. Sinta-se à vontade para nos contactar para mais informações. Aguardamos com expectativa a cooperação consigo num futuro próximo.

Referência:

1. Ziller M. J. et al. Sequenciação de bisulfito direcionada do DNA metiloma dinâmico. Epigenética e cromatina, 2016, 9(1): 55.

Resultados da Demonstração

Perguntas Frequentes sobre Sequenciação de Bisulfito Direcionada

1. Quando deve escolher o sequenciamento de bisulfito direcionado?

A tecnologia de sequenciação de bisulfito direcionada combina a conversão de bisulfito com a amplificação direcionada de regiões de interesse, e o sequenciação de próxima geração. É uma ferramenta rápida e eficiente para a análise de até 10 kb de regiões genómicas alvo em até 96 amostras de cada vez. Os resultados oferecem quantificação absoluta da metilação de citosina com resolução de uma única base. Além disso, este método pode ser utilizado para confirmar os resultados obtidos a partir de sequenciação de bisulfito de genoma completo, sequenciação de bisulfito com representação reduzidae sequenciação por imunoprecipitação de DNA metiladoA sequenciação de bisulfito direcionada permite uma melhor determinação de SNPs e eventos de estado de metilação, além de uma melhor compreensão das doenças humanas.

2. Quais são as vantagens do sequenciamento de bisulfito direcionado em comparação com outras tecnologias de sequenciamento de metilação?

Comparado com estudos de perfilagem de metilação do genoma completo, a deteção de metilação apenas em regiões candidatas selecionadas é uma abordagem mais viável que torna a análise de metilação mais exequível e acessível em diferentes contextos. O sequenciamento de bisulfito direcionado aumenta dramaticamente o rendimento de dados e reduz os custos. Entretanto, também é capaz de detectar o estado de metilação de regiões que não podem ser detectadas por RRBS (sequenciação de bisulfito de representação reduzida) ou imunoprecipitação As abordagens. O sequenciamento de bisulfito direcionado tem sido amplamente aplicado ao sequenciamento de metilação e validação de grandes coortes de amostras em regiões-alvo.

3. Como desenhar sondas ou primers adequados?

Uma aplicação bem-sucedida de sequenciação de bisulfito direcionada depende em grande parte do design adequado de sondas e primers. Existem muitas ferramentas eficazes para gerar sondas ou primers de forma automática, como o ppDesigner (http://genome-tech.ucsd.edu/public/Gen2_BSPP/ppDesigner/ppDesigner.php) e o PRIMEGENSw3 (http://primegens.org). Após obter muitos candidatos a sondas ou primers, o processo de validação é importante para selecionar os mais ótimos.

4. Qual é o fluxo de trabalho do sequenciamento de bisulfito direcionado?

O fluxo de trabalho da sequenciação de bisulfito direcionada baseada em PCR é representado na Figura 1. Quanto à sequenciação de bisulfito direcionada baseada em hibridização, pode ser realizada tanto pela conversão de bisulfito de DNA nativo selecionado por hibridização como pela seleção por hibridização de DNA convertido. E esta última abordagem está agora disponível comercialmente, caracterizando-se por uma superior especificidade de alvo, menores requisitos de entrada de DNA e a capacidade de distinguir uma conversão de bisulfito de C para U de um SNP de C para T.

Figura 1. O fluxo de trabalho da sequenciação de bisulfito direcionada baseada em PCR.

Estudos de Caso de Sequenciação com Bisulfito Direcionada

A sequenciação de metilação direcionada revela sinalização Wnt desregulada na doença de Parkinson.

Revista: Revista de Genética e Genómica

Fator de impacto: 4,051

Publicado: 20 de outubro de 2016

Fundo

Fatores ambientais e genéticos desempenham papéis cruciais na etiologia da doença de Parkinson. Até agora, entendemos que uma série de toxinas ambientais facilita o parkinsonismo em humanos e animais. No entanto, não temos ideia sobre a potencial interação entre o ambiente e a genética na patogénese do Parkinson. Assim, Zhang et al. aplicam tanto a sequenciação de bisulfito direcionada quanto métodos de imuno-histoquímica para estudar os vínculos subjacentes.

Métodos

Resultados

A sequenciação de bisulfito direcionada revelou um aumento da metilação de genes na sinalização Wnt.

Eles projetaram um conjunto de aproximadamente 97.000 sondas de cadeado que cobrem 16.379 regiões de metilação diferencial de tecido validadas (T-DMRs), todos os genes imprintados humanos conhecidos e previstos e os locais de início de transcrição de todos os genes no cromossoma X. A análise de agrupamento K-média resultou em 336 DMRs não sobrepostos, entre os quais foram mapeados a genes conhecidos. E a maioria dessas regiões (230/233) mostrou níveis elevados de metilação nos tecidos cerebrais de PD em comparação com doadores saudáveis. Há um enriquecimento significativo de genes envolvidos na sinalização Wnt e na neurogénese.

2. Deteção reduzida de genes na sinalização Wnt na substância negra de pacientes com PD

Os níveis de Foxc1, Ngn2, Spry1 e β-catenina nos neurónios DA do mesencéfalo estavam notavelmente reduzidos em pacientes com PD em comparação com os controles pareados. A análise quantitativa revelou um aumento significativo de células com expressão reduzida ou indetectável destes genes. Em contraste, o nível de NEDD8 nos neurónios DA tanto de pacientes com PD como de controles permaneceu semelhante, sugerindo que a deteção reduzida destas proteínas nos neurónios DA do mesencéfalo de pacientes com PD é específica. Observações semelhantes foram feitas em relação ao Foxc1 e Spry1 nos tecidos corticais de pacientes com PD e seus controles pareados. No entanto, poucas alterações de Ngn2 e β-catenina foram detectadas nos tecidos corticais de pacientes com PD e seus controles pareados.

3. Regulação negativa da sinalização Wnt em células tratadas com o neurotoxina PD MPP+

A análise de anotação funcional pelo tratamento com MPP+ indica um enriquecimento de genes regulados positivamente que funcionam em ligações dissulfídicas, membrana celular, processos do sistema neurológico, resposta de defesa, adesão celular, regulação positiva da apoptose e regulação da migração. Os clusters de anotação regulados negativamente induzidos por MPP+ incluem genes que funcionam em ligações dissulfídicas, secretados, matriz extracelular, membrana plasmática, sinalização Wnt e sinalização hedgehog. Os resultados apoiam ainda mais a noção de que a sinalização Wnt está comprometida no parkinsonismo induzido por neurotoxinas.

Referência:

1. Zhang L, Jie D, Qian P, et al. O sequenciamento de metilação direcionado revela a desregulação da sinalização Wnt na doença de Parkinson. Revista de Genética e Genómica, 2016, 43(10):587-592.