Diretrizes para Submissão de Amostras
O fluxo de trabalho completo para o sequenciamento de eccDNA. Utilizando a tecnologia de WGS de Baixa Cobertura, este processo permite a extração precisa, construção de bibliotecas e deteção bioinformática de eventos de DNA circular extracromossómico.O que é Sequenciamento de eccDNA?
O DNA circular extracromossómico (eccDNA) refere-se a moléculas de DNA circular de cadeia dupla que existem independentemente dos cromossomos canónicos. Estas estruturas variam em tamanho desde dezenas de pares de bases (pb) até milhões de pares de bases (Mb). O eccDNA está presente de forma ubíqua em organismos eucarióticos, incluindo tecidos humanos saudáveis, lesões neoplásicas e amostras de sangue normais.
Embora as vias moleculares precisas permaneçam incompletamente caracterizadas, a pesquisa atual postula quatro hipóteses principais: a) modelo do Ciclo de Quebra-Fusão-Ponte (BFB), b) modelo de Cromotripe, c) modelo de Translocação-Deleção-Amplificação, d) modelo de Episoma.
fig 1: Mecanismos de formação de eccDNA. (Yiheng Zhao, et al., 2022)
O eccDNA pode transportar diversos componentes genéticos, incluindo fragmentos de genes, sequências repetitivas não codificantes, exões, íntrons, promotores e potenciadores. Através da circularização quimérica e reintegração no genoma linear, o eccDNA participa na remodelação genómica. As suas funções multifacetadas podem regular criticamente a expressão génica, formar superpotenciadores, envolver-se em processos de reparação do DNA e contribuir para a patogénese do câncer.
A sequenciação de eccDNA da CD Genomics é um método de alta capacidade especificamente concebido para identificar, caracterizar e analisar o eccDNA que existe independentemente dos cromossomas no núcleo. O eccDNA está presente de forma ubíqua tanto em tecidos saudáveis como doentes, com papéis biológicos particularmente significativos no câncer—como facilitar a amplificação de oncogenes, aumentar a acessibilidade da cromatina e participar em redes regulatórias de genes. Esta tecnologia de sequenciação fornece, assim, uma abordagem tecnológica essencial para a caracterização aprofundada da estrutura, origens, funções e implicações do eccDNA na doença.
Estratégias de Sequenciação de eccDNA
Oferecemos várias estratégias para sequenciação de eccDNA com base nas suas necessidades de investigação:
Opções de Serviço de Sequenciação de eccDNA
Oferecemos três principais opções de sequenciação de eccDNA para apoiar várias aplicações de investigação:
Sequenciação de eccDNA para Amostras de Tecidos/Células
eccDNA enriquecido em A&A｜sensibilidade de deteção amplificada por RCA｜perfilagem abrangente potenciada por NGS
Sequenciação de eccDNA para Amostras de Biópsia Líquida
Fluxo de trabalho da biblioteca otimizada para Tn5-transposase｜Deteção ultra-sensível de eccDNA｜Quantificação original que preserva a abundância｜Amostra de soro, plasma, urina, LCR, entre outros.
Sequenciação de Metilação de eccDNA para Amostras de Biópsia Líquida
Deteção de dupla função (eccDNA + metilação) | Eficiente em amostras (Tn5 + conversão enzimática) | Precisão de base única (Resolução económica)
Sequenciação WGS padrão vs. Sequenciação de eccDNA
| Recurso | WGS Padrão (Sequenciação Profunda) | Sequenciação de eccDNA (Baixa Cobertura Enriquecida) | |
|---|---|---|---|
| Princípio Fundamental | Sequências de todo o DNA (Linear + Circular) sem distinção. | Enriquece o DNA circular (remove o DNA linear) antes da sequenciação. | |
| Sensibilidade de Detecção | Baixo. Apenas deteta ecDNAs de alta cópia ou grandes (por exemplo, em câncer). Perde microDNAs ou raros. | Ultra-Alto. Deteta quantidades traço, raros eccDNAs e microDNAs (<1kb) que o WGS não consegue identificar. | |
| Fundo de DNA Linear | Alto (>95%). A vasta maioria dos dados é desperdiçada em cromossomas lineares. | Mínimo. O DNA linear é removido enzimaticamente, concentrando as leituras no eccDNA. | |
| Eficiência de Dados | Baixo. Requer alta profundidade (30X-60X, >90Gb) para "encontrar por acaso" círculos. | Alto. Alcança uma cobertura profunda a nível de círculo com apenas 24Gb de dados (Passa-baixas). | |
| Precisão do Ponto de Interrupção | Moderado. Difícil de identificar junções precisas devido ao ruído de fundo. | Preciso. O alto enriquecimento permite a identificação clara de junções "cabeça-a-cauda". | |
| Custo-Efetividade | Caro para a pesquisa de eccDNA (pagando pelo genoma completo). | Custo-Efetivo. Você paga apenas pelos dados circulares relevantes. | |
| Melhor Aplicação | Perfil genómico geral (SNVs, Indels) e deteção de grandes CNVs. | Investigação focada em eccDNA, descoberta de biomarcadores e estudos de mecanismos. |
Aplicações do Sequenciamento de eccDNA
A nossa sequenciação de eccDNA tem inúmeras aplicações em várias áreas de investigação:
- Investigação do CancroEstudar as alterações genéticas que contribuem para a progressão do câncer.
- Estudos de Regulação GenéticaCompreender como o eccDNA influencia a expressão génica e as funções celulares.
- Doença InfecciosaInvestigar genomas virais ou identificar ADN circular em patógenos.
- Doenças GenéticasIdentificar novos fatores genéticos que contribuem para doenças.
- Biologia Agrícola:Aproveitar o eccDNA engenheirado para a melhoria de culturas e entrega de genes biotecnológicos.
- Biologia EvolutivaEstudar variações genéticas entre diferentes espécies.
Fluxo de Trabalho do Serviço de Sequenciação de eccDNA
Na CD Genomics, oferecemos um serviço de sequenciação de eccDNA contínuo e completo, projetado para garantir resultados consistentes e de alta qualidade. O nosso fluxo de trabalho padronizado—desde a submissão da amostra até à entrega dos dados—é construído para apoiar a reprodutibilidade, simplificar a investigação e acelerar a descoberta em todos os tipos de estudos genómicos.
Visão geral do fluxo de trabalho para serviços de sequenciação de eccDNA.
Análise Bioinformática de Sequenciação de eccDNA
A CD Genomics oferece serviços abrangentes e flexíveis. serviços de análise bioinformática, variando desde o processamento de dados básico até análises personalizadas avançadas. As nossas soluções facilitam a exploração aprofundada das variações genómicas e das suas funcionalidades.
- Aquisição de Dados Brutos e QCAquisição de dados de sequenciação de extremidades pareadas do sequenciador, seguida de uma avaliação inicial da qualidade utilizando o limiar Q30.
- Pré-processamento de DadosO corte de adaptadores e a filtragem de leituras de baixa qualidade foram realizados utilizando o cutadapt.
- Alinhamento de GenomasAlinhamento de leituras limpas processadas ao genoma de referência (HG38/hg38) usando bwa.
- Deteção de eccDNADeteção de eccDNA em todas as amostras usando circle-map, aproveitando assinaturas de alinhamento (por exemplo, alinhamentos discordantes, leituras soft-clipped) para inferir a existência de moléculas circulares e posições de quebra.
- Contagem de Leituras Soft-clippedQuantificação de leituras brutas soft-clipped em junções de quebra utilizando samtools.
- Filtragem Diferencial de eccDNANormalização através do edgeR, seguida da identificação de DNA circular diferencialmente expresso com base em limiares de valor p e mudança de fold.
- Anotação de eccDNAAnotação genómica de características de DNA circular utilizando bedtools.
- Análise de Enriquecimento FuncionalAnálise de enriquecimento da Ontologia Genética (GO) de genes associados a DNA circular expressos diferencialmente.
- Análise de Metilação (Opcional)Avaliação estatística dos níveis de metilação do eccDNA.
- Relatórios PersonalizadosResumos personalizados que apresentam dados analisados de forma clara e acionável.
Requisitos de Amostra para Sequenciação de eccDNA
| Tipo de Sequenciamento | Requisitos de Amostra |
|---|---|
| Células | 2× 10⁷ células |
| Tecido | 200mg |
| DNA | ≥10μg, Dissolvido em H₂O livre de nucleases ou tampão TE (pH 8.0); 260/280= 1.7–2.0; Ausência de RNA, contaminação entre espécies ou entre indivíduos. |
| Soro | 5 mL |
| Plasma | 5 mL |
| Urina | 5~10mL |
| Líquido cefalorraquidiano |
|
- Se desejar processar outros tipos de amostras, por favor contacte-nos.
Por que escolher a CD Genomics para sequenciação de eccDNA?
Desde plataformas de sequenciação avançadas até à entrega de dados de alta qualidade, a CD Genomics oferece uma solução eccDNA eficiente e de ponta a ponta, adaptada a diversas necessidades de investigação. A nossa equipa garante resultados fiáveis com um suporte flexível.
- EspecializaçãoMais de 10 anos de experiência em sequenciação e análise de ADN.
- Tecnologia de PontaUtilizamos as mais recentes plataformas de sequenciação e ferramentas de bioinformática.
- Resultados FiáveisO nosso rigoroso controlo de qualidade garante dados altamente precisos e reproduzíveis.
- Serviço FlexívelSuporta tudo, desde amostras únicas até processamento paralelo de múltiplos projetos em alta capacidade.
Referências:
- Møller, Hans D., et al. "Elementos de DNA circular de origem cromossómica são comuns em tecidos somáticos humanos saudáveis." Comunicações da Natureza 9 (2018): 1069. https://doi.org/10.1038/s41467-018-03369-8
- Deshpande, Vineet, et al. "Explorando a paisagem das ampliações focais no câncer usando o AmpliconArchitect." Comunicações da Natureza 10 (2019): 392. https://doi.org/10.1038/s41467-018-08200-y
- Mann, Lena, et al. "ECCsplorer: um pipeline para detectar DNA circular extracromossómico (eccDNA) a partir de dados de sequenciação de nova geração." BMC Bioinformática 23 (2022): 40. https://doi.org/10.1186/s12859-021-04545-2
- Zhao, Yiheng, et al. "DNA circular extracromossómico: Estado atual e perspetivas futuras. eLife 11 (2022): e81412. https://doi.org/10.7554/eLife.81412
- Yang, Zhenzhen, et al. "DNA circular extracromossómico: biogénese, estrutura, funções e doenças." Transdução de Sinal e Terapia Direcionada 7 (2022): 342. https://doi.org/10.1038/s41392-022-00978-7
- Hung, King L., et al. "Herdança coordenada de DNAs extracromossómicos em células cancerígenas. Natureza 635 (2024): 201–210. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07861-8
Demonstração
Resultados da análise da sequenciação de eccDNA mostrando a distribuição de comprimento, características do eccDNA caracterizadas e eventos diferenciais de eccDNA, com regiões associadas a genes e repetitivas.
Perguntas Frequentes
- Posso usar amostras FFPE para sequenciação de eccDNA?
Sim, mas com ressalvas. O DNA de FFPE está frequentemente fragmentado, o que pode impactar a recuperação e a sensibilidade de deteção do eccDNA, especialmente para círculos maiores. O tecido fresco congelado é fortemente preferido. Otimizamos protocolos para FFPE, mas os resultados podem variar. Contacte-nos para discutir a viabilidade.
- Quais ferramentas de bioinformática utiliza principalmente para a deteção de eccDNA?
Utilizamos uma combinação de algoritmos estabelecidos (como Circle-Map, AmpliconArchitect) e ferramentas proprietárias otimizadas para sensibilidade e especificidade. O nosso fluxo de trabalho foca em evidências de leitura de junções e padrões de mapeamento específicos de círculos para minimizar falsos positivos.
- A CD Genomics ajuda na validação funcional a montante do eccDNA identificado?
Enquanto o nosso serviço principal é o sequenciamento e a bioinformática, também oferecemos serviços de validação como FISH, PCR inversa, PCR digital em gotículas e sequenciamento Sanger.
- Como garante a especificidade do seu enriquecimento de eccDNA?
O nosso protocolo otimizado combina a digestão por exonuclease dependente de ATP (degradando DNA linear) com seleção de tamanho baseada em coluna, adaptada para enriquecer moléculas de DNA circular. Realizamos rigorosos controlos de qualidade para confirmar a eficiência de enriquecimento.
- A sequenciação de eccDNA pode detectar outras variações estruturais (SVs)?
Sim, a análise identifica inerentemente pontos de ruptura e variações estruturais presentes dentro do eccDNA. No entanto, está especificamente otimizada para estruturas circulares e pode não captar todas as SVs lineares em todo o genoma tão eficazmente quanto a chamada de SVs dedicada ao WGS.
Estudo de Caso: Validação do eccDNA como Biomarcador Diagnóstico para a Progressão do Cancro Colorretal
TítuloDNA circular extracromossómico como um novo biomarcador para a progressão do câncer colorretal
DiárioMedicina Molecular
Fator de Impacto6.4(2024)
Publicado2025
DOI10.1186/s10020-025-01164-y
Fundo
O diagnóstico precoce do câncer colorretal (CCR) apresenta desafios significativos. A colonoscopia, embora eficaz, é invasiva, e os testes de sangue oculto nas fezes (TSOF) muitas vezes carecem de sensibilidade e especificidade suficientes. Além disso, as biópsias líquidas de DNA tumoral circulante (ctDNA) enfrentam dificuldades com baixas taxas de captura, limitando a sua fiabilidade diagnóstica. Nesse contexto, o DNA circular extracromossómico (eccDNA) surgiu como um novo biomarcador promissor. O eccDNA aparece durante os estágios iniciais da tumorigénese, e a sua abundância correlaciona-se com a progressão do câncer, tornando-o uma ferramenta potencialmente valiosa para a deteção precoce do CCR.
Objetivos do Projeto
- Caracterizar as alterações dinâmicas de eccDNA ao longo da progressão do CRC (do tecido saudável ao pólipo, adenoma e carcinoma).
- Avaliar o potencial do eccDNA como um biomarcador diagnóstico precoce para o CRC.
Materiais e Métodos
Coleta de Amostras
- Amostras Clínicas: Tecidos epiteliais intestinais humanos saudáveis (n=5); Tecidos de pacientes com CRC: Pólipos (n=17), Adenomas (n=14), Tumores (n=29), Tecidos normais adjacentes (n=5).
- Modelos Animais: Modelos de CRC em ratos induzidos por AOM/DSS nos pontos de tempo de 0, 5, 8 e 11 semanas.
Preparar e Sequenciar Ácido Nucleico
- Extração de DNA, depleção de DNA linear, Amplificação em Círculo Rolante (RCA), preparação de biblioteca de DNA.
- Extração de RNA, preparação de biblioteca de RNA.
- Sequenciação no Illumina NovaSeq™ 6000 (PE150).
Análise Bioinformática
- Filtragem e alinhamento de dados.
- identificação, anotação e cálculo de abundância de eccDNA.
- Análise de RNA-seq: Análise de expressão diferencial.
- Correlação entre eccDNA e expressão génica, análise de caminhos KEGG/GO.
Experimentos de Validação
- PCR específica de ponto de interrupção: Validação de estruturas circulares de eccDNA candidatas.
- Validação de modelos animais: Alterações dinâmicas de eccDNA em modelos murinos AOM/DSS.
Principais Conclusões
1.Acumulação Progressiva de eccDNAA abundância aumenta com a progressão do CRC (carcinoma > adenoma > pólipo > normal).
2.Transporte de Genes Associados ao CancroO eccDNA contém genes enriquecidos em vias tumorais (por exemplo, recuperação de nucleotídeos e sinalização do EGFR).
3.Modelo de Diagnóstico de Alto DesempenhoUm classificador de floresta aleatória utilizando 10 genes relacionados com eccDNA (TAFA5/ADA/CRISPLD2) alcançou uma AUC de 0,91 para distinguir lesões precoces de tumores.
4.Mecanismo de Formação73% dos pontos de quebra do eccDNA contêm repetições diretas ou invertidas (eccDNA DR/RR), facilitando a circularização.
Figuras Referenciadas
Implicações
- Potencial de Detecção PrecoceNíveis elevados de eccDNA em estágios precoces de câncer apoiam a sua utilidade como uma ferramenta de biópsia líquida.
- Superioridade TécnicaA estrutura circular estável do eccDNA permite uma maior eficiência na enriquecimento e deteção em comparação com o ctDNA.
- Tradução ClínicaFundação para kits de rastreio de CRC baseados em eccDNA (por exemplo, biomarcadores TAFA5/CRISPLD2).
Referência:
- Qiu, Quanpeng, Yi Ding, Xiaolong Guo, Jing Han, Jiaqi Zhang, Yaping Liu, Junjun She e Yinnan Chen. "DNA circular extracromossómico como um novo biomarcador para a progressão do câncer colorretal."Medicina Molecular 31.123 (2025)." Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e ficarei feliz em ajudar com a tradução.
