Sequenciação de DNA de Célula Única

A CD Genomics oferece amplificação do genoma completo de forma abrangente para descobrir mutações de DNA em células únicas.

A Introdução do Sequenciamento de DNA de Célula Única

Mutações aleatórias e de baixa abundância no genoma de células somáticas são difíceis de qualificar e caracterizar. Para contornar este problema e, simultaneamente, considerar a heterogeneidade mutacional dentro dos tecidos, aplica-se o sequenciamento de um número representativo de células individuais.

A tecnologia de amplificação do genoma completo (WGA) surgiu como uma ferramenta para realizar a avaliação de mutações no DNA em células únicas ou em um número limitado de células. Para permitir a descoberta de verdadeiras variações em células únicas, a WGA de DNA genómico de cópia única a partir de uma única célula é otimizada para obter quantidades suficientes de DNA para sequenciação. Diante do problema da quantidade limitada ou insuficiente de DNA para várias análises subsequentes, o DNA amplificado pode ser utilizado diretamente para sequenciação.

Várias técnicas de WGA foram desenvolvidas. Oferecemos serviços que copiam com precisão o DNA original com a menor taxa de falsos positivos e um protocolo validado bem adequado para a deteção de variações no número de cópias e variações de nucleotídeos únicos em todo o genoma a partir de uma única célula após a amplificação do genoma completo.

Quais são as Vantagens da Sequenciação de DNA de Célula Única

• A deteção direta de mutações a nível genético é de grande importância para a deteção de tumores.
• O DNA apresenta uma maior estabilidade em comparação com o RNA, proporcionando tempo suficiente para o processamento de amostras.
• A sensibilidade de deteção para identificar clones celulares portadores de mutações raras dentro dos tecidos pode atingir níveis tão baixos quanto 0,1%.
• Esta abordagem enfrenta eficazmente o desafio apresentado por amostras mistas.
• Além disso, oferece uma resolução espacial melhorada.
• Olhando para o futuro, a integração de mais análises ómicas em plataformas de DNA de célula única, incluindo a profilagem de proteínas da superfície celular e a análise de metilação em célula única, RNA-seq, e BCR/Sequenciação de TCR , detém imenso potencial.

Quais são as aplicações do sequenciamento de DNA de célula única?

• Para descobrir CNVs e variações de nucleotídeo único (SNVs) em todo o genoma em células únicas ou com entrada ultra-baixa.
• Para obter uma visão base a base de um exoma com resolução de célula única.
• Revelando a Heterogeneidade Celular
• Rastreio do Desenvolvimento Embrionário e da Diferenciação Celular
• Investigação do Desenvolvimento Tumoral e Resistência Terapêutica
• Explorando a Funcionalidade do Sistema Imunitário
• Compreensão da Estrutura e Função do Sistema Neural
• Análise da Composição da Comunidade Microbiana

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de DNA de Célula Única

O advento de tecnologias de separação/particionamento de células, como a citometria de fluxo e a microfluídica, tornou possível capturar células individuais, e a amplificação do genoma completo (WGA) é otimizada para fornecer altos rendimentos de DNA genómico completo para sequenciação. O fluxo de trabalho geral para a sequenciação de DNA de células únicas está delineado abaixo.

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra Recomenda-se o uso de placas de 96 poços com suspensão de células vivas para este procedimento. Células congeladas em lisados congelados específicos também podem ser usadas como material de partida. >1000 pg de DNA extraído. Células Quantidade e Qualidade Recomendada: 1-103As células individuais são armazenadas em tampão 1xPBS (sem Ca).2+, Mg2+), o volume está dentro de 2 μL Quantidade e Qualidade Recomendada de DNA ≥ 0,5pg
	Sequenciação HiSeq X Ten Profundidade de cobertura ≥ 30x Mais de 85% das bases com uma pontuação de qualidade ≥Q30
	Análise Bioinformática Controlo de qualidade de dados brutos Alinhamento com o genoma de referência Chamada de SNP/InDel/SV/CNV Anotação e estatísticas Análise avançada: distúrbios monogénicos, distúrbios complexos/multifatoriais e cancro.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em Sequenciação de Células Únicas para a sua escrita (personalização)

A conferência de Sequenciação de DNA de Células Únicas da CD Genomics foca nas ligações entre a variação celular nos tecidos e a função dos órgãos, além de elucidar as origens das doenças. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Referências:

1. Deleye, L et al. Desempenho de quatro métodos modernos de amplificação do genoma completo para deteção de variantes de número de cópias em células únicas. Relatórios científicos, 2017 Jun 13; 7(1): 3422.
2. Dong, X et al. Identificação precisa de variantes de nucleotídeo único em células únicas amplificadas por genoma completo. Métodos NatareMaio de 2017; 14(5): 491–493.

1. O que é sequenciação de DNA de célula única?

O sequenciamento de DNA de célula única refere-se a uma técnica sofisticada Sequenciação de DNA método que envolve a análise de material genético obtido apenas de uma única célula. Isso confere aos cientistas a capacidade de perceber e compreender os padrões comportamentais distintos exibidos por cada célula.

2. Por que é que a sequenciação de DNA a partir de células únicas é importante?

A importância do sequenciamento de DNA a nível de célula única decorre da sua capacidade intrínseca de permitir o estudo e a análise das variações genéticas presentes em células individuais que coexistem num único tecido ou organismo. A consciência dessas diferenças pode estabelecer as bases para destacar quaisquer irregularidades ou anomalias a nível celular. Consequentemente, isso pode abrir caminho para novas percepções sobre a origem e evolução das doenças, ao mesmo tempo que ajuda no desenvolvimento de modalidades de tratamento direcionadas e eficazes.

3. Como é que o sequenciamento de DNA de célula única é diferente dos métodos tradicionais de sequenciamento de DNA?

Tradicional Sequenciação de DNA métodos amalgamam dados genéticos de uma multitude de células, obscurecendo assim a heterogeneidade inerente entre células individuais. Em contraste, o sequenciamento de DNA de célula única facilita a análise de células singulares, revelando, portanto, esta diversidade celular oculta.

4. O princípio, vantagens e desvantagens da amplificação do genoma de células únicas.

i. MDA (Amplificação de Deslocamento Múltiplo)

Inventado por Laskin et al. em 2001. Reagiu utilizando primers de polímero aleatórios de seis unidades e a DNA polimerase φ29, que tinha fortes propriedades de substituição de cadeia e podia amplificar o fragmento de DNA de 50~100kb em condições isotérmicas. Ao mesmo tempo, devido à sua atividade exonuclease 3'-5' e atividade de correção, a DNA polimerase φ29 tem alta fidelidade. O método MDA tem uma cobertura genómica superior.

ii. MALBAC (Ciclos de Amplificação Baseados em Múltiplos Reannealings e Looping)

O processo de amplificação quasilinear reduz a preferência de sequência da amplificação exponencial. Os primers amplificados de 5' contendo a sequência comum de 27bp e 3' é uma sequência aleatória de 8bp, que pode ser combinada com o molde a baixa temperatura entre 15 a 20 °C, e depois amplificar esses amplicons em forma de anel após a amplificação quasilinear de 8 a 12 ciclos.

A vantagem do método MALBAC é que a preferência de sequência é repetível entre diferentes células. Devido à sua melhor homogeneidade de amplificação, os seus dados são mais adequados para a análise de CNV. A fraqueza do MALBAC é que a fidelidade da polimerase utilizada não é tão boa quanto a da polimerase de DNA φ29, portanto, o MALBAC terá mais falsos positivos ao detectar SNV; além disso, devido à sua preferência de sequência repetível, a região de baixa amplificação no genoma é por vezes perdida no processo de amplificação.

5. Como funciona o sequenciamento de DNA de célula única?

Isolamento Celular:

A isolação de células individuais de uma população heterogénea é realizada com precisão, utilizando técnicas sofisticadas como a separação de células ativada por fluorescência (FACS), microfluídica ou microdissecação a laser.

Amplificação do Genoma:

O DNA extraído da célula isolada passa por procedimentos de amplificação para gerar material suficiente para análises posteriores. Métodos estabelecidos como Amplificação por Deslocamento Múltiplo (MDA) e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) são comumente utilizados para este fim.

Construção de Biblioteca:

Após a amplificação, as moléculas de DNA são fragmentadas e adaptadores especializados são introduzidos para facilitar as etapas de sequenciação subsequentes. Esta fase crucial envolve processos meticulosos, incluindo a fragmentação do DNA, reparação das extremidades, ligação dos adaptadores e amplificação subsequente.

Sequenciação de Nova Geração (NGS):

As bibliotecas meticulosamente preparadas são então submetidas a tecnologia de ponta. sequenciação de próxima geração plataformas como a Illumina, PacBioou Oxford NanoporeDurante a sequenciação, os fragmentos de ADN são lidos meticulosamente, resultando em informações de sequência abrangentes.

Análise de Dados:

Os dados de sequenciação bruta passam por um processamento e análise rigorosos para identificar variantes genéticas, incluindo variações de nucleotídeo único (SNVs), variações no número de cópias (CNVs) e variações estruturais (SVs). Avançado bioinformática ferramentas e algoritmos são utilizados para a chamada de variantes, alinhamento e interpretação meticulosa.

6. Quais são as técnicas para amplificação do genoma completo?

No âmbito da amplificação do genoma completo, surgem várias vias técnicas proeminentes:

• Uma dessas abordagens está enraizada na metodologia de PCR, exemplificada pelo DOP-PCR (PCR com Primers Oligonucleotídeos Degenerados).
• Outro caminho envolve técnicas de amplificação isotérmica, tipificadas pela MDA (Amplificação por Deslocamento Múltiplo).
• Além disso, metodologias que combinam PCR com amplificação isotérmica, como o MALBAC (Ciclos de Amplificação Baseados em Múltiplas Anexações e Laços), representam uma abordagem distinta.
• Além disso, existe uma categoria baseada em mecanismos de transposase, exemplificada pelo LIANTI e META-CS.

A tecnologia MDA destaca-se como prevalente e amplamente adotada no domínio da amplificação do genoma completo. Além disso, o MALBAC, que aproveita as vantagens combinadas da PCR e da amplificação isotérmica, tem uma importância particular em áreas como o sequenciamento de células únicas. Embora o LIANTI e o META-CS apresentem desenvolvimentos promissores em abordagens baseadas em transposase, a sua adoção e reconhecimento generalizados ainda não correspondem aos do MDA e do MALBAC.

7. Quais são alguns dos desafios do sequenciamento de DNA a partir de células únicas?

Os desafios inerentes consistem na potencial perda de material genético durante as etapas de isolamento celular e extração de DNA, imprecisões introduzidas durante o processo de amplificação e o considerável investimento financeiro necessário para esta tecnologia.

8. Qual é a perspetiva futura para o sequenciamento de DNA de célula única?

O futuro está repleto de perspetivas para o sequenciamento de DNA a partir de células únicas. Os avanços tecnológicos prometem diminuir os custos e aumentar a capacidade de processamento, promovendo assim uma utilização mais ampla. A agregação de dados genómicos de células únicas também acelerará a criação de modelos mais sofisticados do desenvolvimento humano e da progressão de doenças.

Genómica de alto rendimento, com resolução de estirpes, aplicada a um microbioma intestinal humano

Revista: Ciência
Fator de impacto: 60,528
Publicado: 3 de Jun de 2022

Fundo

O microbioma intestinal humano representa um ecossistema complexo e individualizado caracterizado por uma multitude de espécies microbianas. A presença de estirpes diversas dentro de uma única espécie pode ter efeitos significativos na saúde, incluindo a influência nos perfis de resistência a antibióticos e a modulação das interações com o microbioma do hospedeiro. Consequentemente, um foco restrito nas espécies microbianas sem consideração das suas estirpes específicas pode resultar na omissão de nuances críticas. Apesar da importância da resolução a nível de estirpe, a composição genómica do microbioma intestinal a este nível permanece em grande parte inexplorada, mesmo dentro de um único indivíduo.

Enquanto metagenómica de shotgun oferece um inquérito abrangente dos genomas de comunidades microbianas, mas geralmente não consegue capturar variações a nível de estirpe. Por outro lado, as metodologias baseadas em cultura e o sequenciamento de células únicas em placas de titulação apresentam oportunidades para elucidar genomas resolvidos por estirpe. No entanto, estas abordagens são limitadas pela sua capacidade restrita de abranger um amplo espectro de estirpes microbianas.

Métodos

Resultados

Os investigadores utilizaram o Microbe-seq para analisar sete amostras do microbioma intestinal obtidas de um único sujeito humano, resultando na aquisição de 21.914 genomas amplificados individualmente (SAGs). Estes SAGs foram coassemblados em 76 genomas ao nível das espécies, muitos dos quais originaram de espécies que são difíceis de cultivar. Entre estes genomas, dez espécies compreendiam múltiplas estirpes, cujos genomas também foram coassemblados. Utilizando estes genomas resolvidos por estirpe, os autores reconstruíram a rede de transferência horizontal de genes (HGT) dentro deste microbioma. Observaram uma troca genética frequente entre espécies de Bacteroidetes, particularmente associada a um elemento móvel que abriga um sistema de secreção Tipo-VI, conhecido por mediar a competição entre estirpes.

Além disso, o método de encapsulação baseado em gotículas facilitou a exploração das associações físicas entre micróbios individuais e bacteriófagos co-localizados. Notavelmente, uma associação significativa entre hospedeiro e fago foi descoberta entre o crAssphage, o bacteriófago mais prevalente documentado no microbioma intestinal humano, e uma estirpe específica de Bacteroides vulgatus.

Fig. 1. Esquema do fluxo de trabalho Microbe-seq e aplicação numa comunidade de estirpes bacterianas conhecidas.

Fig. 2. Genomas coassemblados de 76 espécies bacterianas no microbioma intestinal de um único doador humano.

Fig. 3. Genomas resolvidos por estirpe de B. vulgatus no microbioma intestinal humano.

Fig. 4. HGT entre estirpes bacterianas no microbioma intestinal humano de um único dador.

Conclusão

Os investigadores utilizaram o Microbe-seq, uma metodologia que integra a manipulação de gotículas microfluídicas com uma análise bioinformática personalizada, para realizar uma exploração resolvida por estirpes da arquitetura genómica dentro do microbioma intestinal de um indivíduo. Esta abordagem demonstra versatilidade e pode ser facilmente adaptada para investigar diversos ecossistemas microbianos, incluindo aqueles presentes no solo e em ambientes marinhos. A expansão da aplicação desta metodologia a uma coorte humana mais ampla e a integração do Microbe-seq com técnicas complementares, como triagem funcional, separação e sequenciação de longas leituras, promete melhorar significativamente a nossa compreensão do microbioma intestinal e das suas interações complexas com a saúde humana.

Referência:

1. Zheng W, Zhao S, Yin Y, et al. Genómica de micróbios únicos em alta capacidade, com resolução de estirpe, aplicada a um microbioma intestinal humano. Ciência, 2022, 376(6597): eabm1483.