Sequenciação de Ecrã CRISPR

Introdução ao Sequenciamento de Tela CRISPR

A triagem eficaz com CRISPR começa com uma biblioteca meticulosamente desenhada de RNAs guia únicos (sgRNAs) que visam genes ou loci específicos. O processo de design envolve a seleção de sequências apropriadas, a síntese dos sgRNAs e, subsequentemente, a clonagem destes em vetores ou a transcrição em RNA para a transfecção celular. A triagem é então realizada utilizando metodologias de seleção positiva ou negativa. Após a transfecção, as células são fisicamente separadas em populações distintas, seguidas de amplificação por PCR e sequenciação paralela de alto rendimento. A análise de dados identifica subsequentemente os sgRNAs e os genes-alvo correspondentes de interesse.

A utilização da tecnologia de triagem CRISPR para ensaios de alto rendimento facilita a geração de extensas bibliotecas celulares mutantes, que podem ser submetidas a várias condições externas para isolar subconjuntos de células mutantes. Sequenciação de alto débito e as análises de bioinformática elucidam ainda mais as relações entre fenótipos e genótipos. Este rastreio de alto rendimento baseado em CRISPR/Cas9 oferece vantagens significativas em relação às técnicas de rastreio por interferência de RNA (RNAi), incluindo a superação de problemas relacionados à baixa eficiência de transfecção e à capacidade limitada de suprimir a expressão gênica a nível de mRNA.

Na era da medicina de precisão, a triagem CRISPR possui um enorme valor científico e oferece um vasto potencial para aplicações de pesquisa. Este método proporciona uma abordagem robusta, simples e programável para a edição genética em larga escala—frequentemente referida como edição genética em todo o genoma ou de alto rendimento—que demonstrou uma eficácia substancial, particularmente na pesquisa em mamíferos.

Para responder às necessidades emergentes das comunidades de investigação, a CD Genomics desenvolveu uma estratégia acessível, fiável e de alto rendimento para sequenciação de CRISPR Screen, aproveitando a sequenciação de próxima geração baseada em amplicões. O nosso serviço de sequenciação de CRISPR Screen pode fornecer informações diretas e detalhadas sobre a análise de sgRNA e genes-alvo, bem como análise de enriquecimento funcional, para ajudar os investigadores a estudar as funções dos genes de forma de alto rendimento.

Figura 1. Visão geral da triagem CRISPR.

Vantagens do Nosso Serviço de Sequenciação de Ecrãs CRISPR

• Triagem Eficiente: Permite editar múltiplos genes simultaneamente, possibilitando uma triagem e avaliação eficaz das funções genéticas.
• Avaliação Abrangente: Fornece uma abordagem sistemática para avaliar as funções dos genes dentro de células ou organismos.
• Modificações Genéticas Precisas: Alvo de áreas genómicas específicas para alcançar edições genéticas precisas, como knockouts ou mutações.
• Interpretação Rápida de Dados: Utiliza tecnologia de sequenciamento avançada para uma análise de dados rápida e precisa.
• Aplicações Versáteis: Amplamente aplicadas na descoberta de alvos terapêuticos, estabelecimento de modelos de doenças e avanço do desenvolvimento terapêutico.
• Processos Otimizados: Aumenta a eficiência e reduz custos em comparação com métodos convencionais, acelerando os esforços de investigação.
• A flexibilidade de multiplexação extensiva e o sequenciamento de alto rendimento permitem quantificar e comparar as frequências de sgRNAs.
• Deteção económica e altamente sensível sem viés.
• Não há necessidade de etapas de clonagem laboriosas e que consomem muito tempo.
• Apoio dedicado de cientistas especializados com doutoramento.

Aplicações da Sequenciação de Ecrãs CRISPR

• Estudos de Função Gênica: O Sequenciamento de Tela CRISPR permite que os pesquisadores explorem sistematicamente as funções dos genes em células ou organismos, particularmente os seus papéis em processos biológicos complexos e no desenvolvimento de doenças.
• Descoberta de Alvos de Medicamentos: Através de triagens em larga escala e análise de edições genómicas, podem ser descobertos e avaliados potenciais alvos de medicamentos e o seu papel no tratamento de doenças.
• Estabelecimento de Modelos de Doença: Com base nos resultados de sequenciação de triagens CRISPR, podem ser estabelecidos modelos de doença mais precisos para estudar os mecanismos da doença e selecionar abordagens terapêuticas.

Fluxo de Trabalho de Sequenciamento de Tela CRISPR

A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade seguindo todos os procedimentos para garantir resultados abrangentes e precisos. O nosso fluxo de trabalho de sequenciação de CRISPR Screen está descrito abaixo, incluindo isolamento de DNA, experiências de PCR, sequenciação e análise bioinformática. A nossa sequenciação de CRISPR Screen também pode ajudar os investigadores a identificar quais os knockouts de genes que produziram fenótipos relevantes para o Screen.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Tipos de amostras: células ou amostras de DNA após seleção positiva/negativa. Amostra de ADN: ~1,5 μg (concentração ≥ 30 ng/μl; OD260/280=1,8~2,0) Amostra celular: 5×106 células Nota: As quantidades de amostra são apresentadas apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Plataformas Illumina HiSeq Paired-end de 150 bp ou 300 bp Análise de métricas de qualidade de sequenciação
	Análise Bioinformática Oferecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: QC de dados brutos Alinhamento de referência análise da abundância de sgRNA Análise diferencial das abundâncias de sgRNAs Nota: Os resultados de dados e os conteúdos de análise recomendados apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de Ecrãs CRISPR para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece serviços para identificar sequências de sgRNA e genes-alvo de interesse, seguidos de sequenciação profunda, a preços altamente competitivos. As nossas capacidades permitem a sequenciação simultânea de centenas de amostras. Utilizamos a ferramenta MAGeCK para a análise da abundância de sgRNA e da expressão diferencial entre grupos. Se tiver algum requisito ou dúvida adicional, não hesite em contactar-nos.

Referências

1. Ella H, et al.Triagens genéticos e genómica funcional utilizando a tecnologia CRISPR-Cas9. Revista FEBS, 2015, 1383-1393.
2. Zhou Y, et al.Triagem de alto rendimento de uma biblioteca CRISPR/Cas9 para genómica funcional em células humanas. Natureza, 2014, 509(2):487-491.

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Perguntas Frequentes sobre Sequenciamento de Tela CRISPR

1. Como projetar bibliotecas de sgRNA para sequências de genoma completo ou genoma parcial?

O design de bibliotecas de sgRNA para sequenciação de genoma completo ou parcial é um aspecto crítico da utilização eficaz da tecnologia CRISPR-SCREEN. Alcançar uma alta eficiência de edição, minimizar efeitos fora do alvo e garantir mutações de frameshift após a inativação de genes requer uma avaliação abrangente de múltiplos fatores. As seguintes considerações-chave são essenciais para um design ótimo de sgRNA:

• Análise do conteúdo de GC;
• Seleção de posições de corte;
• Análise das estruturas secundárias na sequência;
• Avaliação da especificidade do gRNA;
• Evitar sequências no gRNA (excluindo PAM) com quatro ou mais nucleotídeos T consecutivos na sequência alvo;
• Previsão da pontuação de eficiência da sequência de gRNA;
• Avaliação de potenciais efeitos fora do alvo e incompatibilidades na sequência do gRNA.

2. Que tipos de triagens CRISPR podem ser realizadas?

• Ecrãs de Seleção PositivaIdentificar genes cuja interrupção confere uma vantagem de crescimento ou resistência sob condições específicas.
• Ecrãs de Seleção NegativaIdentificar genes cuja interrupção leva a uma perda de viabilidade ou sensibilidade a tratamentos específicos.
• Ecrãs AgrupadosUtilize uma população mista de células transduzidas com diferentes sgRNAs, permitindo uma análise de alto rendimento.
• Ecrãs DispostosCada poço ou amostra contém células transduzidas com um único sgRNA, facilitando uma análise fenotípica detalhada.

3. Como assegura efeitos off-target mínimos na sequenciação de ecrãs CRISPR?

• Design de sgRNAUtilize ferramentas de bioinformática para desenhar sgRNAs com alta especificidade para locais-alvo e com um número mínimo de locais fora-alvo previstos.
• ValidaçãoRealizar experiências para validar a especificidade dos sgRNAs selecionados.
• Variantes de Cas9 de alta fidelidadeUtilize variantes de Cas9 projetadas para reduzir a atividade fora do alvo.

4. Como é que analisa os dados da Sequenciação de Ecrãs CRISPR?

A análise de dados envolve várias etapas:

• Controlo de Qualidade de Dados de SequenciaçãoVerifique a qualidade das leituras de sequenciamento.
• Mapeamento de LeiturasAlinhe as leituras ao genoma de referência para identificar sequências de sgRNA.
• Identificação de ImpactosDetermine quais sgRNAs estão significativamente enriquecidos ou depletados em comparação com os controlos.
• Análise FuncionalInterprete a importância biológica dos hits identificados, frequentemente utilizando ferramentas de bioinformática para analisar vias e interações genéticas.

Estudos de Caso de Sequenciação CRISPR Screen

Triagem de biblioteca CRISPR/Cas9 em todo o genoma identifica o PCMT1 como um impulsionador crítico da metastização do câncer de ovário.

Revista: Revista de Pesquisa Experimental e Clínica em Cancro

Fator de impacto: 12,568

Publicado: 15 de janeiro de 2022

Fundo

A metastização do câncer envolve a migração e invasão das células tumorais, exigindo resistência à anoikis. A matriz extracelular (MEC) é crucial neste processo. Usando triagem de knockout CRISPR/Cas9 em células de câncer de ovário, o PCMT1 foi identificado como essencial para a resistência à anoikis. O PCMT1 interage com a proteína da MEC LAMB3, ativando vias que ajudam na adesão e invasão celular. A elevação do PCMT1 em metástases destaca seu potencial como alvo terapêutico.

Materiais e Métodos

Resultados

Um rastreio genómico com CRISPR/Cas9 em células de cancro do ovário identificou genes associados à resistência à anoikis. Utilizando a biblioteca GeCKO v2, as células SKOV3 foram rastreadas em condições padrão e de ultra-baixa adesão. O sequenciamento revelou 286 genes da seleção negativa e 122 da seleção positiva. As vias-chave incluíram reparação de proteínas e iniciação da tradução, com genes conhecidos de resistência à anoikis como RAN, KIF11 e ECT2 também identificados.

Fig 1. Um rastreio CRISPR em todo o genoma agrupado num modelo de metástase de cancro do ovário.

A IP-MS identificou que a PCMT1 interage com a LAMB3. Entre as 39 proteínas que interagem com a PCMT1 e que têm alta confiança, a LAMB3 foi associada a características de metastização celular. Estudos funcionais confirmaram a interação entre a PCMT1 e a LAMB3, e o silenciamento da LAMB3 reduziu a formação de esferoides celulares e a migração em células de câncer de ovário que superexpressam a PCMT1, indicando que a LAMB3 é um alvo a jusante da PCMT1 na metastização do câncer.

Fig. 2. A IP-MS indica que a PCMT1 interage com a LAMB3.

Conclusão

Em resumo, este estudo identifica a PCMT1 como um fator chave na resistência à anoikis, melhorando a adesão celular, migração e invasão. A PCMT1 regula positivamente a sinalização FAK-Src, promove a metastização e correlaciona-se com o estágio metastático no câncer de ovário. Níveis elevados de PCMT1 no soro podem indicar potencial metastático, e a abordagem de direcionar a PCMT1 com anticorpos mostra-se promissora como uma estratégia terapêutica para a metastização do câncer de ovário.

Referência

1. Zhang J, Li Y, Liu H, et al. O rastreio de biblioteca CRISPR/Cas9 em todo o genoma identifica o PCMT1 como um impulsionador crítico da metastização do câncer de ovário. Revista de Experimental & Pesquisa Clínica em Cancro, 2022, 41(1): 24.