RNA-Seq de Entrada Ultra-Baixa (SMART-seq)

A Introdução da Sequenciação de RNA Ultra-Baixa

Oferecemos um serviço de sequenciação de RNA de ultra-baixo input que permite o estudo de amostras com um número limitado de células ou com uma quantidade extremamente baixa de RNA de input. A sequenciação de RNA de ultra-baixo input permite que os investigadores explorem a verdadeira diversidade da expressão gênica dentro de pequenas populações celulares em tecidos complexos e compreendam as respostas das subpopulações celulares a estímulos ambientais. Proporciona uma nova ferramenta poderosa para a análise de amostras excepcionalmente raras ou preciosas — incluindo células-tronco, células tumorais circulantes e biópsias de tecido cerebral.

A CD genomics faz o uso mais amplo possível de tecnologia comprovada na indústria para gerar cDNA de alta qualidade com níveis ultra-baixos de RNA, combinado com sequenciação Illumina, para fornecer uma nova ferramenta poderosa para a análise destes amostras extremamente limitadas. Oferecemos vários serviços diferentes para obter um retrato preciso dos níveis de expressão de RNAs codificantes e não codificantes a partir de pequenas entradas de amostra.

A partir de quantidades de picogramas de RNA ou de algumas centenas de células, a tecnologia atual oferece uma sensibilidade sem igual e uma amplificação imparcial de transcritos de cDNA, enriquecendo para transcrições completas e mantém a verdadeira representação do original transcritos de mRNA.

Enquanto NGS A tecnologia contribuiu significativamente para a nossa compreensão do mRNA celular, mas também revelou a existência de uma vasta variedade de RNAs não codificantes que desempenham papéis diversos em processos como a regulação da expressão génica. O sequenciamento de RNA total com ultra baixo input permite a entrega de dados que incluem tanto mRNA como lncRNA, possibilitando a análise desta importante classe de RNAs regulatórios.

Também oferecemos um serviço de RNA pequeno de entrada ultra baixa, que trabalha diretamente com RNA total ou enriquecido. pequeno RNA entradas que variam desde quantidades de nanogramas de RNA. Permite que os investigadores analisem uma ampla gama de espécies de smRNA e gerem bibliotecas de sequenciamento de considerável complexidade a partir de apenas 1 ng de material de entrada, garantindo que diversas espécies de smRNA sejam representadas com viés mínimo.

Vantagens e Características do Sequenciamento de RNA Ultra-Baixo

• Amostra de solução de dados com a mais alta qualidade de dados e menor custo.
• Quantificação precisa de genes e sensibilidade incomparável para entradas de RNA ultra-baixas.
• Análise poderosa dos níveis de expressão génica e isoformas alternadamente splicing, caracterização de pequenos RNAs e descoberta de genes.
• O método de sequenciação de RNA de entrada ultra-baixa visa minimizar os vieses de amplificação enquanto preserva a representação das espécies de RNA presentes na amostra original. Ao otimizar as etapas de transcrição reversa e amplificação por PCR, os artefatos artificiais são minimizados, garantindo uma compreensão abrangente do transcriptoma.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de RNA Ultra-Baixa

Os nossos serviços abrangentes de sequenciação de RNA ultra baixo oferecem a Sequenciação de RNA fluxo de trabalho desde a preparação da amostra até à análise de dados, permitindo um perfil rápido e uma profunda compreensão do RNA.

Especificação de Serviço

	Requisitos de Amostra RNA total ≥ 20 ng, Quantidade mínima: 20 pg, Concentração ≥ 1 pg/µL Relação OD A260/A280 ≥ 1.8, relação A260/230 ≥ 1.8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar livres de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciação llumina NovaSeq 6000 PE 50/75/100/150 Pontuação de qualidade Q30 de ≥80% 20 milhões de leituras
	Análise de Dados Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Análise de expressão gênica diferencial Análise da estrutura do RNA Predição de genes-alvo e análise funcional Deteção de transcritos e mutações novos e raros Previsão de transcrição de romance gráfico PCA, mapa de calor, análise de vias Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em Sequenciamento de RNA Ultra Baixo para a sua escrita (personalização)

Aproveitando a nossa equipa de especialistas experientes e tecnologia de ponta, a CD Genomics oferece um serviço especializado de Sequenciamento de RNA Ultra Baixo. A nossa plataforma fornece dados de sequência de RNA de alta resolução através de rigorosos processos de garantia de qualidade e análises bioinformáticas avançadas, garantindo uma precisão e sensibilidade incomparáveis.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciamento

Distribuição A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

1. O que é Sequenciação de RNA Ultra Baixa?

O Sequenciamento de RNA Ultra Baixo (ULRS) representa uma tecnologia de ponta projetada para produzir dados de sequenciamento altamente precisos a partir de quantidades minúsculas de amostras de RNA. Este método está estrategicamente posicionado para abordar questões biológicas complexas, como o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq), a análise de populações celulares raras e o perfilamento de RNA extraído de espécimes clínicos.

2. Quais são as aplicações da Sequenciação de RNA com Ultra Baixo Input?

A Sequenciação de RNA com Ultra Baixo Input é fundamental em múltiplos domínios: permite que a scRNA-seq investigue transcriptomas celulares, identifica tipos celulares raros e extrai RNA de amostras clínicas para insights diagnósticos. Na biologia do desenvolvimento e na pesquisa de células-tronco, a ULRS elucida a dinâmica da expressão gênica, oferecendo perfis de RNA mais detalhados em diversos contextos biológicos, avançando assim a compreensão científica.

3. Quais são os requisitos para amostras em Sequenciação de RNA a Ultra Baixas Temperaturas?

Na Sequenciação de RNA Ultra Baixo (ULRS), a integridade das amostras é um fator crítico para evitar a deterioração do RNA, exigindo entradas de RNA de alta qualidade. A sensibilidade do método a quantidades mínimas de RNA destaca a compatibilidade de amostras que variam de picogramas a nanogramas. Manter a pureza da amostra serve como uma salvaguarda fundamental contra contaminantes que podem distorcer os resultados da sequenciação.

4. O que deve ser considerado na análise de dados para Sequenciação de RNA Ultra Baixo?

Durante a análise de dados em Sequenciamento de RNA em Ultra Baixa Quantidade, a pré-processamento meticuloso dos dados torna-se imperativo para validar a qualidade e minimizar o ruído, aumentando a precisão nas análises subsequentes. A avaliação dos níveis de expressão génica foca na quantificação precisa, enquanto uma análise aprofundada da anotação funcional ajuda a desvendar o significado biológico dos genes expressos diferencialmente. A análise de integração aumenta ainda mais os insights ao amalgamar Sequenciação de RNA dados com outros conjuntos de omicas, proporcionando assim uma compreensão abrangente dos mecanismos biológicos.

Avaliação da sequenciação de RNA com ultra-baixo input para o estudo do transcriptoma de células T humanas

Revista: Scientific Reports
Fator de impacto: 4,996
Publicado: 11 de junho de 2019

Resumo

Compreender a biologia das células T é essencial para o desenvolvimento terapêutico. Este estudo avaliou métodos de sequenciação de RNA de ultra-baixa entrada, constatando que o AmpliSeq detetou consistentemente genes codificantes mesmo com entradas baixas, enquanto o SMART detetou genes não codificantes, mas mostrou variabilidade em entradas muito baixas. Todos os métodos identificaram assinaturas de ativação das células T com 1.000 células, sendo que o AmpliSeq teve um desempenho melhor com 100 células.

Materiais e Métodos

Resultados

Os autores avaliaram três kits de extração de RNA (PicoPure, Zymogen, Qiagen RNeasy micro kit) em células T CD4 naïve humanas primárias (5K, 1K, 100 células). O kit Qiagen RNeasy micro proporcionou a melhor consistência, especialmente com 100 células, e foi escolhido para estudos adicionais. As células T tratadas com α-CD3 ou α-CD3 e B7-1 Fc foram utilizadas para a preparação da biblioteca de RNA com as tecnologias SMART-Seq (Nextera: SMART_Nxt, Clontech: SMART_CC) e AmpliSeq. O AmpliSeq mostrou taxas de alinhamento mais altas (81-92%) do que o SMART-Seq (59-74%), com detecção estável de genes em diferentes quantidades. O SMART-Seq detectou menos genes com a diminuição das entradas e conseguiu detectar genes não codificantes, que o AmpliSeq não consegue avaliar.

A análise de expressão gênica diferencial em RNA-seq fornece informações críticas sobre processos biológicos. Usando 100 K amostras de células como referência, SMART_Nxt, SMART_CC e AmpliSeq identificaram 7762, 7923 e 6662 GEsD, respetivamente, entre os tratamentos α-CD3 + B7-1 Fc e α-CD3 (FDR < 0.05). 4261 GEsD foram comuns a todas as plataformas, mostrando mudanças de dobra consistentes (R2 = 0.94 para SMART_Nxt/SMART_CC, R2 = 0.84 para AmpliSeq/SMART_CC, R2 = 0.85 para SMART_Nxt/AmpliSeq). Os GEsD específicos da plataforma exibiram padrões de expressão distintos e variabilidade entre réplicas técnicas.

Fig. 1. Três plataformas diferentes detetaram genes diferencialmente expressos comuns; no entanto, também foi observada a deteção específica de cada plataforma.

Os autores avaliaram a deteção de DEG em diferentes entradas celulares, constatando que o AmpliSeq identificou consistentemente mais DEGs do que o SMART_Nxt e o SMART_CC em entradas celulares mais baixas, com a diminuição do número de DEGs a correlacionar-se com a redução das quantidades de entrada. Por exemplo, o AmpliSeq detetou 6662 DEGs em 100 K células, 3382 em 5 K, 844 em 1 K e 90 em 100 células, mostrando uma queda significativa no número de DEGs à medida que a entrada celular diminuía. O AmpliSeq também demonstrou maior sensibilidade na deteção de DEGs significativos em entradas mais baixas em comparação com o SMART_Nxt e o SMART_CC. Além disso, a GSEA revelou o enriquecimento de vias relacionadas à ativação de células T em amostras tratadas com α-CD3 + B7-1 Fc, destacando os processos biológicos afetados pela ativação celular.

Fig. 2. O número de genes diferencialmente expressos diminuiu com a redução da entrada, a precisão da deteção manteve-se robusta e o AmpliSeq demonstrou maior sensibilidade.

Neste estudo, os autores compararam 15 genes envolvidos na ativação de células T através de diferentes tecnologias. Com entradas mais elevadas (100 K, 5 K, 1 K), todas as tecnologias apresentaram um desempenho semelhante na deteção de alterações na expressão génica. Com uma entrada de 100 células, o AmpliSeq identificou uma significativa regulação positiva de 7 genes (CD200, CD69, EGR1, FASLG, IL2, MYC, TNF), enquanto o SMART_Nxt e o SMART_CC detetaram menos genes (1 cada). Notavelmente, o TNFSF14 foi detetado apenas pelo SMART_Nxt e pelo SMART_CC, mesmo com entradas mais elevadas. O qRT-PCR confirmou a expressão diferencial para 12 dos 16 genes, destacando problemas com a deteção de IL-21, possivelmente devido a limitações dos primers.

Fig 3. A deteçã dos marcadores de ativação de células T bem conhecidos foi alcançada com uma entrada de 1 K células e acima, e o AmpliSeq detetou uma percentagem mais alta destes genes com uma entrada de 100 células.

Conclusão

Neste estudo, as tecnologias de RNA-seq (SMART_Nxt, SMART_CC e AmpliSeq) foram avaliadas para estudar as alterações na expressão génica em células T durante a ativação. A AmpliSeq mostrou um desempenho superior na deteção de genes de forma consistente em diferentes níveis de entrada, mantendo a sensibilidade para genes de baixa expressão. No entanto, o SMART_Nxt e o SMART_CC demonstraram uma maior concordância entre si na deteção de genes específicos, possivelmente devido à sua tecnologia SMART partilhada. Em entradas extremamente baixas (100 células), a AmpliSeq exibiu uma melhor sensibilidade na deteção de alterações na expressão génica biologicamente relevantes em comparação com as tecnologias SMART.

Referência:

1. Wang, J., Rieder, S.A., Wu, J. et al. Avaliação da sequenciação de RNA com ultra-baixa entrada para o estudo do transcriptoma de células T humanas. Sci Rep, 2019, 9, 8445.