ATAC-Seq

A CD Genomics agora é capaz de fornecer Assay para Cromatina Acessível a Transposase com sequenciação de alto rendimento (ATAC-seq), um método para mapear a acessibilidade da cromatina em todo o genoma. O método é uma alternativa rápida e sensível ao DNase-seq (sequenciação de locais hipersensíveis ao DNase I) ou MNase-seq (sequenciação de locais sensíveis à nuclease micrococcal). Ao utilizar o nosso serviço, pode detetar perfis em todo o genoma de regiões abertas e acessíveis da cromatina que são indicativas de regiões regulatórias ativas.

A Introdução do ATAC-Seq

O genoma eucariótico está altamente compactado para caber no espaço nuclear muito limitado. Como resultado, o acesso à informação genómica é rigidamente regulado com base no estado celular. Quais regiões do genoma são acessíveis revela muito sobre o estado da célula. O ATAC-seq é uma técnica para localizar regiões de cromatina acessíveis.

O acrónimo ATAC-seq significa Assay for Transposase Accessible Chromatin using sequencing, uma técnica que examina a acessibilidade da cromatina pela transposase através de sequenciação. Esta abordagem envolve a clivagem de regiões de cromatina aberta em contextos temporais e espaciais específicos pela transposase, capturando assim sequências regulatórias de genes ativamente transcritos dentro do genoma nesse intervalo específico. Requerendo apenas um pequeno número de células, este método fornece informações em tempo real sobre as sequências regulatórias que controlam a atividade em todo o genoma. As suas aplicações incluem análise de ligação de fatores de transcrição, posicionamento de nucleossomas e a distribuição de elementos regulatórios, oferecendo vastas perspetivas no campo da investigação epigenética.

ATAC-seq é uma técnica inovadora na investigação epigenética que utiliza a transposase Tn5 para clivar e rotular locais de cromatina aberta, permitindo a sequenciação eficiente de mapas de acessibilidade da cromatina. A transposase Tn5 liga-se aleatoriamente e corta o DNA em regiões de cromatina aberta, inserindo simultaneamente sequências de adaptadores nos locais de clivagem. Ao introduzir o complexo de transposase que transporta etiquetas de sequência de DNA conhecidas (ou seja, transposase Tn5 com etiquetas de sequência vermelha e verde) no núcleo para co-incubação, seguido pela amplificação por PCR utilizando as etiquetas de sequência conhecidas, pode-se gerar uma biblioteca, e a sequenciação pode fornecer informações sobre regiões de cromatina aberta.

Vantagens do ATAC-Seq

• Obtenha uma compreensão mecanicista da regulação genética, resposta celular ao tratamento ou à doença.
• Identificar quais fatores de transcrição estão a conduzir o destino celular, a doença ou a resposta.
• Amostras de pacientes limitadas
• Baixos requisitos quanto à quantidade da amostra biológica, e todo o protocolo requer 3 horas no total.

Aplicações do ATAC-Seq

• Posicionamento de nucleossomas
• Identificação de fatores de transcrição chave
• Deteção de regiões promotoras, potenciais potenciadores ou silenciadores
• Integração de dados multi-ómicos
• Mapeamento da acessibilidade da cromatina
• Identificação de genes-alvo regulados por fatores de transcrição

Fluxo de Trabalho ATAC-Seq

A parte chave do procedimento ATAC-seq é a ação da transposase Tn5 no DNA genómico da amostra. As transposases são enzimas que catalisam o movimento de transposões para outras partes do genoma. Embora as transposases que ocorrem naturalmente tenham um nível baixo de atividade, o ATAC-seq utiliza uma transposase hiperativa mutada. A alta atividade permite um corte altamente eficiente do DNA exposto e a ligadura simultânea de sequências específicas, chamadas adaptadores. Os fragmentos de DNA ligados a adaptadores são então isolados, amplificados por PCR e utilizados para sequenciação de próxima geraçãoO pipeline experimental do ATAC-seq é demonstrado na Figura 1.

Figura 1. Fluxo de trabalho esquemático do processo ATAC-seq.

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra Tipo de amostra: Tecidos humanos, de rato e de camundongo, Células vivas, não ADN genómico. Célula ≥ 1 x106Quantidade Mínima: 5 x104 Tecido ≥ 500 mg, Quantidade Mínima: 200 mg Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciação Illumina HiSeq PE50 ou PE150. Para algumas aplicações, como o mapeamento de nucleossomas, a sequenciação de extremidades pareadas é preferida. Illumina HiSeq PE150. ≥50M Leituras.
	Análise de Dados Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade Mapeamento do genoma de referência Chamada de pico Anotação Análise diferencial Descoberta de motivos Nota: Os dados de saída recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em ATAC-Seq para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics garante que iremos fornecer um serviço de alta qualidade, e a nossa equipa profissional não o decepcionará. Com mais de 10 anos de experiência a servir investigadores em todo o mundo na área de NGS, acredito que podemos ser a solução. Não hesite em contactar-nos se tiver alguma dúvida sobre o nosso serviço.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

1. Que tipo de controlos são necessários para experimentos de ATAC-Seq?

No âmbito dos experimentos ATAC-Seq, a incorporação de diversos controlos é imperativa para manter a precisão e a fiabilidade. A utilização de um controlo de DNA de entrada serve para normalizar potenciais enviesamentos nos processos de preparação e sequenciação de DNA. Os replicados técnicos desempenham um papel crucial na confirmação da reprodutibilidade e fiabilidade dos resultados. A inclusão de controlos positivos, que representam regiões de cromatina aberta estabelecidas, atua como um mecanismo para autenticar o protocolo. Por outro lado, os controlos negativos, indicativos de regiões de cromatina fechada esperadas, ajudam na deteção e mitigação do ruído de fundo.

2. Como é que o ATAC-Seq se compara a outros ensaios de acessibilidade da cromatina, como o DNase-Seq e o FAIRE-Seq?

DNase-Seq, ATAC-Seq e FAIRE-Seq são técnicas utilizadas para estudar regiões de cromatina aberta. DNase-Seq utiliza a endonuclease DNase I para identificar regiões de cromatina acessíveis, FAIRE-Seq envolve sonicação seguida de enriquecimento com fenol-clorofórmio, e ATAC-Seq utiliza a transposase Tn5 para enriquecimento e amplificação. A alta atividade da transposase Tn5 torna o ATAC-Seq um método simples e eficiente que requer apenas 500-50.000 células. A sensibilidade e especificidade do ATAC-Seq são comparáveis às do DNase-Seq e superiores às do FAIRE-Seq.

3. Quais técnicas são frequentemente combinadas com ATAC-seq para investigação?

ATAC-seq + RNA-seqGeralmente, a RNA-seq é realizada antes da ATAC-seq para identificar genes expressos diferencialmente e vias enriquecidas, que sugerem correlações. Para determinar quais fatores regulam esses genes-alvo, a análise de motivos através da ATAC-seq pode identificar potenciais elementos reguladores. A validação subsequente pode ser realizada através de experimentos adicionais ou ChIP-seq.

ATAC-seq + Hi-CPara estudos que investigam os efeitos das estruturas de cromatina de ordem superior em processos biológicos, o ATAC-seq é frequentemente utilizado em conjunto com o Hi-C. O Hi-C fornece informações sobre estruturas de ordem superior, como compartimentos A/B, TADs e laços, que indicam correlações. O ATAC-seq pode ainda identificar promotores, potenciadores e outros elementos, elucidando como essas estruturas influenciam a expressão génica.

ATAC-seq + Modificações de HistonasEmbora o ATAC-seq possa prever a acessibilidade de locais específicos e a potencial ligação de fatores de transcrição, não revela se esses fatores promovem ou inibem a expressão génica. Combinar o ATAC-seq com dados de modificação de histonas (por exemplo, H3K27ac para ativação ou H3K27me3 para repressão) pode proporcionar uma compreensão mais abrangente, tornando os dados mais robustos e fiáveis.

Análises multiómicas dos efeitos da luz branca LED na maturação de frutos de damasco

Revista: Revista de Pesquisa Avançada
Fator de impacto: 12,822
Publicado: Disponível online a 9 de janeiro de 2024

Fundo

DamascoPrunus armeniaca L.nativo da Ásia Central e amplamente cultivado em regiões como o Mediterrâneo e a China, é popular pela sua cor, sabor e nutrientes, mas tem uma vida útil curta de 3 a 5 dias. O processo de amadurecimento e senescência, regulado pelo etileno, envolve mudanças fisiológicas complexas. Apesar de extensas pesquisas, as alterações nos metabolitos e os mecanismos regulatórios durante o armazenamento pós-colheita não são totalmente compreendidos. Os diodos emissores de luz (LEDs) oferecem um método ecológico para prolongar a vida útil, atrasando a senescência e mantendo a qualidade. Este estudo investiga os efeitos da luz branca LED na qualidade do fruto de damasco, transcriptoma, metaboloma e acessibilidade da cromatina, com o objetivo de melhorar os métodos de armazenamento e prolongar a vida útil.

Materiais e Métodos

Resultados

Neste estudo, a transcriptómica de frutos utilizou o PCC como índice para avaliar a correlação entre réplicas biológicas, mostrando valores elevados (>0,9), indicando uma forte semelhança (Fig. 1F). A análise revelou padrões de expressão gênica diferencial nas comparações: CK-0 d vs. CK-8 d (6.256 DEGs), CK-0 d vs. LED-8 d (8.110 DEGs) e CK-8 d vs. LED-8 d (1.792 DEGs), com sobreposições variáveis (Fig. 1I). A enriquecimento KEGG e GO destacou vias como a biossíntese de metabolitos secundários e papéis regulatórios dos DEGs no sabor, textura, cor, biossíntese de etileno, fatores de transcrição e processos oxidativos. A luz LED regulou 56 DEGs na maturação dos frutos, impactando vias metabólicas e atividades transcricionais.

Fig. 1. Efeitos do tratamento com LED na qualidade fisiológica e na transcrição de frutos de damasco.

Análises transcriptómicas e metabolómicas combinadas revelaram que, sob irradiação LED, a UDP-sugar pirofosforilase (USP) foi regulada positivamente, aumentando a síntese de D-glucuronato, enquanto a inositol oxigenase (MIOX) e a aldeído desidrogenase (ALDH) foram reguladas negativamente, reduzindo a acumulação de mio-inositol. O tratamento com LED também diminuiu a acumulação de L-deidroascorbato ao afetar as atividades da L-ascorbato peroxidase (APX) e da L-ascorbato oxidase (AO). Além disso, os aumentos induzidos por LED nos níveis de cinamoil-CoA regularam positivamente a chalcone sintase (CHS) e a florizina sintase (PTG1), alterando o metabolismo dos flavonoides e promovendo a biossíntese de antocianinas através da regulação positiva da diidroflavonol 4-redutase (DFR).

Fig. 2. A via metabólica da biossíntese de flavonoides foi analisada através da combinação de dados de transcriptoma e metaboloma.

A análise ATAC-seq de frutos de damasco após tratamento com LED revelou 616,85 milhões de leituras limpas com altas percentagens de bases Q30, indicando uma qualidade de dados robusta. A análise de correlação mostrou uma forte reprodutibilidade entre os replicados biológicos dentro de cada grupo. A análise diferencial identificou 4492, 1769 e 123 regiões diferencialmente acessíveis (DARs) em CK-0 d vs. CK-8 d, CK-0 d vs. LED-8 d, e CK-8 d vs. LED-8 d, respetivamente. A análise de motivos destacou 76 fatores de transcrição (TFs), incluindo fatores responsivos ao etileno (ERF2, ERF9, ERF069, ERF104 e MYB124), implicados na regulação das DARs e genes-alvo. Estas descobertas sublinham as alterações induzidas pelo LED na acessibilidade da cromatina e na regulação dos TFs, influenciando a expressão génica e o desenvolvimento dos frutos de damasco.

Fig. 3. Visão geral dos dados ATAC-seq da maturação do fruto de damasco.

Fig. 4. (A) Expressão diferencial de genes e mapa de calor das regiões de cromatina abertas. (B) O caminho metabólico da biossíntese de fenilpropanoides foi analisado combinando os dados do transcriptoma, metaboloma e ATAC-seq.

Em frutos de damasco tratados com LED, a integração de análises transcriptómicas e ATAC-seq revelou genes com acessibilidade à cromatina e níveis de expressão alterados. A HCT apresentou acessibilidade à cromatina reduzida e diminuição da expressão génica, enquanto a POD e a 4CL mostraram alterações variáveis na acessibilidade acompanhadas de uma regulação mista da expressão génica, com upregulação e downregulação.

A análise metabolómica destacou a biossíntese de fenilpropanoides como significativamente afetada pelo tratamento com LED. Alterações na expressão de HCT influenciaram a acumulação de metabolitos específicos, como o ácido p-coumaroil shikímico e o ácido cafeoil quínico. A POD e a 4CL, com acessibilidade à cromatina alterada e expressão gênica variada, desempenharam papéis nas vias de síntese de lignina, cruciais para manter a qualidade da fruta de damasco durante o armazenamento.

Fig. 5 Modelo da rede regulatória da luz LED durante a maturação de frutos de damasco colhidos.

Conclusão

O tratamento com LED alterou as vias de metabolismo do ácido ascórbico e uronato, a biossíntese de flavonoides e a biossíntese de fenilpropanoides em frutos de damasco, influenciando a expressão génica relacionada com a sinalização hormonal das plantas, a qualidade dos frutos e a atividade antioxidante. Esta pesquisa destaca o potencial do LED para prolongar o armazenamento e a vida útil de frutas e legumes.

Referência:

1. Bai C, Zheng Y, Watkins CB, et al.Análises multiómicas dos efeitos da luz branca LED na maturação dos frutos de damasco. Revista de Pesquisa Avançada. 2024.