Serviço de Sequenciação de Metilação de RNA por Nanoporos

A CD Genomics oferece serviços de Sequenciação de Metilação de RNA por Nanopore de última geração para revelar padrões de modificação m6A diretamente a partir de moléculas de RNA. O nosso método de alto rendimento permite uma análise com resolução de base única, proporcionando informações detalhadas sobre a epigenética do RNA. Este serviço apoia investigações sobre regulação genética, metabolismo do RNA e mecanismos de doenças.

O que é Sequenciação de RNA por Nanoporos

A metilação do DNA e a metilação do RNA são processos facilitados por metiltransferases, onde um grupo metilo (CH3) é adicionado a um átomo específico numa molécula de DNA ou RNA. No RNA celular, foram identificados mais de 100 tipos de modificações químicas. Várias modificações de metilação do RNA incluem a metilação m6A do RNA, a metilação m5C do RNA, a metilação m1A do RNA, a metilação m7G do RNA, entre outras. Dentre estas, a mais proeminente e amplamente estudada é a metilação m6A do RNA, que ocorre no sexto átomo de nitrogênio do resíduo de adenina em moléculas de RNA (N6-metiladenosina, m6A). Esta modificação representa a modificação pós-transcricional mais comum no mRNA eucariótico, constituindo aproximadamente 80% de todas as modificações de metilação do RNA.

A sequenciação de metilação de RNA ONT é realizada utilizando tecnologia de nanoporos. Os nanoporos são pequenos poros com um diâmetro na faixa dos nanómetros. Quando uma única cadeia de RNA passa através de um nanoporo, gera alterações na corrente elétrica. Estas flutuações de corrente podem ser registadas com precisão e decifradas por algoritmos específicos para revelar a informação da sequência de RNA juntamente com as suas modificações de metilação. O aspecto chave da tecnologia ONT reside na sua capacidade de sequenciar diretamente longas moléculas de RNA e detectar várias modificações no RNA, incluindo N6-metiladenina (m6A), 5-metilcitosina (m5C) e outras.

Métodos para Detetar a Metilação de RNA

MeRip-seq (Imunoprecipitação de RNA Metilado):

O MeRip-seq baseia-se no princípio da ligação específica de anticorpos a bases metiladas. Utiliza anticorpos específicos para m6A para imunoprecipitação, a fim de enriquecer fragmentos de RNA que sofrem metilação. Sequenciação de alto rendimento é então empregue para detetar transcritos com modificações m6A. No entanto, este método só pode identificar regiões com alta metilação e carece de resolução a nível de base única para reconhecer a metilação do RNA.

Tecnologia de Sequenciação por Nanoporos:

Sequenciação por nanoporo é um sequenciação de leitura longa tecnologia baseada no reconhecimento de sinais elétricos de sequências base. Diferentes modificações nas bases de RNA causam variações no tamanho da obstrução à medida que passam por um canal de nanoporo, gerando sinais elétricos característicos. O monitoramento em tempo real desses sinais permite a determinação dos tipos de bases correspondentes e se elas apresentam modificações nas bases. Em outras palavras, a sequenciação por nanoporo pode realizar diretamente sequenciação do transcriptoma em comprimento total em amostras de RNA natural sem a necessidade de ligação específica de anticorpos. Permite a deteção de modificações de metilação m6A (N6-metiladenosina) no RNA com resolução de base única, ao mesmo tempo que fornece a expressão quantitativa de genes/transcritos e a identificação da estrutura do transcrito.

Princípios da Sequenciação de Metilação de RNA por Nanoporos

A tecnologia de sequenciação por nanoporo aproveita a deteção de sinais gerados quando uma única molécula passa através de um nanoporo, causando uma diferença de potencial de cada lado do poro. O diâmetro do nanoporo permite apenas que polímeros de nucleótidos individuais passem. A natureza carregada das diferentes bases, incluindo aquelas com modificações metiladas, varia, permitindo a deteção dos tipos de bases correspondentes e da informação de metilação através de diferenças nos sinais elétricos.

Vantagens do Serviço de Sequenciação de Metilação de RNA por Nanoporos

• Resolução de Nucleotídeos Únicos em Todo o Transcritoma: Identificação de modificações de metilação m6A com resolução de nucleotídeo único em todo o transcritoma.
• Leitura Direta da Informação de Metilação m6A: Extração direta da informação de metilação m6A sem a necessidade de experimentos de enriquecimento por imunoprecipitação.
• Quantificação Simultânea da Expressão de Genes/Transcritos e Estrutura do Transcrito: Condução de uma análise quantitativa da expressão de genes/transcritos e investigação da estrutura do transcrito de forma simultânea.
• Ausência de Transcrição Reversa e Viés de PCR: Sequenciação de RNA direta por nanopore elimina a necessidade de interrupção, transcrição reversa e amplificação por PCR, permitindo a análise direta sequenciação do transcriptoma de comprimento completo de amostras de RNA natural.

Aplicações da Sequenciação de Metilação de RNA por Nanoporos

• Investigação do papel funcional dos participantes moleculares envolvidos nos processos de metilação do RNA durante doenças ou processos de vida específicos.
• Desvendando as alterações nas modificações de metilação do RNA durante doenças ou processos de vida específicos, elucidando assim padrões de metilação m6A do RNA específicos de doenças.
• Explorando a relação entre modificações específicas de metilação de RNA e doenças durante doenças ou processos vitais específicos.
• Identificação de novas moléculas envolvidas em modificações de metilação de RNA ou estabelecimento de novas metodologias para o estudo de modificações de metilação de RNA.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Metilação de RNA com Nanoporos

Fig 1. Etapas de preparação da biblioteca utilizando as Tecnologias Oxford Nanopore. (Nicky Jonkhout et al., 2017)

Especificações de Serviço

	Requisitos de Amostra Espécies: Humano, rato e camundongo apenas, outras espécies a serem avaliadas. RNA total ≥ 15 μg Célula ≥ 1 x107 As amostras de RNA devem ter RIN ≥ 8. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Sequenciação por Nanoporos O comprimento médio de leitura pode atingir dezenas a centenas de kb, com os comprimentos de leitura mais longos a ultrapassarem 2Mb.
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Deteção de Metilação de RNA m6A: Análise comparativa dos níveis de metilação m6A em diferentes motivos. Análise comparativa dos níveis de metilação m6A entre diferentes amostras. Investigação funcional dos níveis de metilação m6A. Quantificação da Expressão de Genes/Transcritos e Identificação de Variações Estruturais de Transcritos: Quantificação precisa da expressão de genes/transcritos ao nível do transcrito para identificar transcritos expressos diferencialmente. Identificação de genes funcionais. Detecção precisa de splicing variável, poliadenilação alternativa (APA), genes de fusão, etc. Análise de Correlação: Análise de correlação entre a metilação de RNA m6A e a expressão de genes/transcritos. Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de Metilação de RNA Nanopore para a sua escrita (personalização)

Explore a metilação de RNA com o Sequenciamento de Metilação de RNA Nanopore da CD Genomics. Oferecemos sequenciamento direto de RNA e uma análise bioinformática abrangente para descobrir padrões epigenéticos. Contacte-nos para avançar os seus conhecimentos de investigação.

Referência

1. Jonkhout N, Tran J, Smith MA, et al. O panorama das modificações de RNA na doença humana. RNA2017, 23(12):1754-69.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

1. Quais moléculas estão envolvidas nos processos de modificação do RNA?

No processo de modificação do RNA, várias moléculas-chave estão envolvidas. Os "writers", como METL3 e METTL14, catalisam a metilação do RNA, com a WTAP a desempenhar um papel crucial neste complexo metiltransferase. Estas enzimas facilitam a metilação m6A do mRNA (e de outros RNAs nucleares) tanto in vitro como in vivo. Por outro lado, os "erasers" como FTO e ALKBH5 são responsáveis por remover os sinais de metilação m6A do RNA, mediando assim o processo de desmetilação. Os "readers", por sua vez, são proteínas que interpretam a informação modificada no RNA e participam em processos subsequentes como a tradução e o splicing. Proteínas com domínios YTHDF, por exemplo, podem reconhecer e ligar-se ao m6A no mRNA, levando a uma diminuição na estabilidade do mRNA e promovendo a sua degradação.

2. Que tipos de metilação de RNA podem ser detetados com a Sequenciação de Metilação de RNA por Nanopore?

Este método pode detectar várias modificações de metilação de RNA, incluindo N6-metiladenosina (m6A), 5-metilcitosina (m5C) e outras.

3. Quais aplicações de investigação podem beneficiar da Sequenciação de Metilação de RNA por Nanopore?

Esta tecnologia é valiosa para estudar a regulação epigenética da expressão génica, o processamento de RNA e vários processos biológicos influenciados por modificações de RNA. Permite aos investigadores explorar mudanças dinâmicas nos padrões de metilação de RNA sob diferentes condições.

4. Como é que a sequenciação de metilação de RNA Nanopore se compara a outros métodos como MeRIP-seq ou CM-seq?

Ao contrário dos métodos baseados em anticorpos (por exemplo, MeRIP-seqou abordagens de modificação química (por exemplo, CM-seq), a Sequenciação de Metilação de RNA por Nanopore lê diretamente sequências de RNA e modificações em tempo real, oferecendo vantagens em cobertura abrangente e redução de viés.

5. Quais são alguns resultados típicos da Sequenciação de Metilação de RNA por Nanopore?

Os resultados incluem perfis de metilação detalhados de transcritos de RNA, visualização de padrões de metilação (por exemplo, gráficos de violino), análise de metilação diferencial e anotações funcionais de locais metilados ao longo do transcriptoma.

Mediado por FIONA1 m⁶Uma Modificação Regula a Transição Floral em Arabidopsis

Revista: Ciência Avançada

Fator de impacto: 17,521

Publicado: 05 de janeiro de 2022

Fundo

m6A é uma modificação comum do mRNA, crítica para a regulação genética, afetando o processamento, a estabilidade e a tradução do mRNA. Técnicas como m6A-seq, m6A-CLIP, e sequenciação por nanoporo habilitar o mapeamento preciso de locais de m6A em todo o transcriptoma. Em ArabidopsisA deposição de m6A envolve metiltransferases complexas que visam regiões e motivos específicos do mRNA. O FIO1, identificado como uma nova metiltransferase m6A, influencia o tempo de floração ao regular os níveis de m6A em genes-chave como o SOC1. O sequenciamento por nanoporo revela insights sobre a dinâmica do m6A, destacando o papel do FIO1 no desenvolvimento das plantas e no controlo da expressão génica.

Materiais e Métodos

Resultados

Perturbar o FIO1 em Arabidopsis reduz ligeiramente os níveis globais de m6A do mRNA. O FIO1, semelhante ao METTL16 humano, contém um domínio de metiltransferase conservado e é amplamente expresso em Arabidopsis tecidos. Os mutantes (fio1-1 e fio1-2) exibem floração precoce, com fio1-2 a mostrar uma diminuição na expressão de FIO1. A análise confirma diminuições de aproximadamente 14% e 10% nos níveis de m6A no RNA total e no mRNA dos mutantes fio1-2 em comparação com plantas do tipo selvagem, indicando o envolvimento de FIO1 na metilação m6A.

A Figura 1 FIO1 afeta a floração e os níveis de mRNA m6A em Arabidopsis.

O sequenciamento direto de RNA por nanoporo de mutantes fio1 identificou 3459 locais hipometilados de m6A em sequências codificantes (CDS). Esta abordagem, utilizando a análise xPore, destacou uma preferência pelo motivo YHm6AGA e revelou reduções nos níveis de m6A principalmente antes dos códons de paragem. A análise funcional ligou essas alterações à floração precoce em mutantes fio1, confirmando o papel do FIO1 como uma metiltransferase m6A essencial para a modificação de mRNA e regulação do desenvolvimento em Arabidopsis.

Figura 2 Distribuição de locais hipometilados em fio1-2.

metilação m6A mediada por FIO1 em Arabidopsis influencia a abundância do transcrito e a poliadenilação alternativa (APA), afetando principalmente genes enriquecidos em sequências codificantes (CDS). Locais hipometilados em mutantes fio1 correlacionam-se com a expressão gênica reduzida, incluindo o regulador chave da floração SOC1. O FIO1 modula diretamente o SOC1 e outros genes do relógio circadiano, prolongando o seu período de expressão e impactando indiretamente o tempo de floração. Estas descobertas destacam o FIO1 como uma metiltransferase m6A distinta que visa regiões específicas do mRNA para regular processos de desenvolvimento nas plantas.

A Figura 3 FIO1 regula a abundância de transcritos e a poliadenilação alternativa.

Figura 4 Um modelo proposto que ilustra a função do FIO1 na modificação m6A e no controlo do tempo de floração em Arabidopsis.

Conclusão

Este estudo revela o FIO1 como uma metiltransferase m6A única em plantas, modificando principalmente as sequências codificantes de transcritos específicos de proteínas. A metilação m6A mediada pelo FIO1 influencia a abundância de transcritos e a poliadenilação alternativa, enquanto mostra um efeito mínimo na splicing alternativa. Importante, o FIO1 regula o SOC1 e os seus reguladores a montante, modulando assim o tempo de floração. Estas descobertas aumentam a nossa compreensão da dinâmica do m6A em plantas e estabelecem paralelos com a modificação de RNA mediada pelo METTL16 em animais.

Referência

1. Xu T, Wu X, Wong CE, et al. Mediação FIONA1‐m⁶Uma modificação regula a transição floral em Arabidopsis. Ciência Avançada. 2022, 9(6):2103628.