TCR-Seq e BCR-Seq de Alta Qualidade para Perfilagem do Repertório Imune

Representações comuns de dados relacionados com TCR. (Frank et al., 2023)

Para que é utilizada a sequenciação de TCR?

A sequenciação de TCR representa uma abordagem técnica crítica para investigar a diversidade e a composição clonal dos recetores de células T (TCRs), bem como as suas funções durante as respostas imunes e os processos de doença. Oferece uma ferramenta eficaz para monitorizar o estado e a função das células T em casos de rejeição de transplantes, infeções e terapias imunossupressoras. Ao analisar os repertórios de TCR no sangue periférico ou nos tecidos de um paciente, a nossa compreensão da recuperação da função imunitária e da progressão da doença pode ser significativamente aprimorada.

A sequenciação de TCR facilita uma compreensão mais profunda da maturação, diferenciação e função das células T. Permite revelar os mecanismos regulatórios genéticos e epigenéticos dos TCRs, juntamente com as suas interações com outras células imunes e vias de sinalização, através da investigação da diversidade de TCR e da infraestrutura clonal.

Em tumor imunoterapia, análise da composição do TCR de tumor os linfócitos infiltrantes (TILs) podem ajudar na avaliação da potencial resposta de um paciente à imunoterapia. Além disso, em doenças autoimunes, a análise da composição do TCR das células T de um paciente pode servir para descobrir respostas imunes anormais e proliferação clonal.

Através da exploração da composição do TCR das células T, é possível identificar biomarcadores prováveis de resposta terapêutica e avaliar ainda mais o impacto farmacodinâmico dos tratamentos no sistema imunitário.

Como selecionar materiais para investigação de sequenciação TCR?

A metodologia para TCR-Seq pode ser delineada em duas categorias salientes com base no material primário utilizado: DNA e RNA. Os métodos baseados em DNA destacam-se pela sua capacidade de quantificar clones individuais de TCR com precisão, uma vez que cada célula possui um template único. No entanto, essa singularidade pode potencialmente contribuir para um aumento no custo total do TCR-Seq. Por outro lado, os métodos baseados em RNA oferecem um alto grau de sensibilidade, permitindo uma estimativa quantitativa tanto da abundância de TCR como da expressão génica. Além disso, os métodos baseados em RNA podem facilmente combinar-se com códigos de barras moleculares para reduzir o viés de PCR e aumentar a precisão da identificação de variantes raras.

Quais são as vantagens e desvantagens de duas estratégias de construção de bibliotecas de TCR?

Os métodos primários para sequenciação do receptor de células T (TCR) são a PCR multiplex (mPCR) e a Amplificação Rápida das Extremidades de cDNA 5' (5'RACE). A mPCR, que suporta tanto a iniciação de DNA como de RNA, geralmente compreende duas rondas de PCR. A primeira ronda visa amplificar o locus do gene do receptor e incorpora sequências conhecidas para os locais dos primers da segunda ronda de PCR, com adaptadores de sequenciação e índices a serem posteriormente incorporados. No entanto, a alta diversidade nos locais dos primers nos locais de sobreposição na primeira ronda de PCR exige um grande número de primers degenerados, predispondo assim a um viés de PCR.

A técnica 5'RACE, por outro lado, utiliza RNA como molde e requer apenas um par de primers por ronda de PCR. Isso reduz significativamente o viés da PCR e garante que os resultados reflitam com precisão a condição autêntica das amostras.

Qual é a diferença entre TCR e BCR?

receptores de células T (TCR) e Receptores de células B (BCR) representam classes distintas de recetores imunitários que exibem diferenças significativas tanto em função como em estrutura. Como os seus nomes sugerem, estes recetores estão presentes nas superfícies de diferentes tipos de células. O TCR, uma construção relativamente mais simples, consiste apenas em duas cadeias, enquanto o BCR compreende quatro cadeias. Uma função cardinal do TCR consiste em reconhecer peptídeos antigénicos especificamente apresentados na superfície celular, tipicamente apresentados por moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC). Por outro lado, o papel principal do BCR é a identificação de moléculas antigénicas que estão livres numa solução, abrangendo uma variedade de entidades moleculares, incluindo proteínas, polissacarídeos, entre outros.

A resposta imunitária mediada pelos TCRs diz respeito principalmente à imunidade mediada por células, abrangendo o reconhecimento e a eliminação de microorganismos infecciosos e células tumorais. Por outro lado, as respostas imunitárias mediadas pelos BCRs envolvem principalmente a imunidade humoral, estendendo-se à geração de anticorpos e à neutralização e eliminação de antígenos. Os TCRs, expressos principalmente nas células T nos tecidos linfóides, participam na modulação das respostas imunitárias celulares. Por sua vez, os BCRs, predominantemente expressos nas células B, intervêm nas respostas imunitárias humorais.

A sequenciação do receptor de células T revela características imunológicas do carcinoma hepatocelular de acordo com os estágios do câncer de fígado da Clínica de Barcelona dentro do tecido hepático e do sangue periférico.

Revista: Ciência do Cancro
Fator de impacto: 5.7
Publicado: 14 de novembro de 2023

Fundos

Os linfócitos T, que reconhecem as moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) através do receptor de células T (TCR) encontrado na sua superfície celular, são fundamentais para a resposta imunitária adaptativa humana. O carcinoma hepatocelular (CHC) ocupa o quarto lugar a nível global em termos de mortalidade relacionada com o câncer. O microambiente imunitário do CHC abrange diferentes subgrupos funcionais de linfócitos T. Atualmente, as características clonais e a diversidade dos TCRs em diferentes estágios do CHC permanecem em grande parte inexploradas. As mais recentes descobertas de pesquisa, publicadas na Cancer Science pela equipa liderada pelo Professor Wang Yijin na Universidade do Sul de Ciência e Tecnologia, procuram examinar as características imunológicas das células T originárias de diferentes tecidos em vários estágios do CHC. Esta pesquisa contribuirá para elucidar os mecanismos de progressão do CHC e abrirá caminho para o desenvolvimento de métodos terapêuticos baseados em células que visem neoantígenos específicos.

Métodos

Resultados

1. Análise da heterogeneidade interpaciente das sequências CDR3

Este estudo examinou sequências CDR3 partilhadas em todos os tipos de amostras de 25 pacientes com HCC. A percentagem de sequências CDR3 partilhadas entre tecidos adjacentes e tecidos tumorais foi de 4,3%, e entre PBMCs e tecidos tumorais foi de 1,5%. Não foram observadas diferenças significativas nas sequências CDR3 partilhadas entre tecidos adjacentes e tecidos tumorais, ou entre PBMCs e tecidos tumorais em todos os três estádios. Embora os clonótipos TCR partilhados fossem limitados em tecidos adjacentes e PBMCs, houve mais clonótipos TCR partilhados nos tecidos tumorais do estádio BCLC_C em comparação com os estádios BCLC_A e BCLC_B. A similaridade TCR foi avaliada utilizando o Índice de Jaccard, revelando maior similaridade em tumores em comparação com tecidos adjacentes, mas semelhante a PBMCs. Pacientes no estádio BCLC_C exibiram maior similaridade TCR em todos os tipos de amostras. O Índice de Sobreposição de Morisita foi utilizado para avaliar quantitativamente os clonótipos sobrepostos, indicando um maior grau de sobreposição em pacientes do estádio BCLC_C em comparação com os estádios BCLC_A e BCLC_B, embora não estatisticamente significativo.

Figura 1. Análise da heterogeneidade interpaciente das sequências CDR3

2. Diversidade e clonalidade das sequências CDR3

O estudo investigou a expressão dos segmentos de genes V e J, focando nas sequências CDR3 para avaliar a diversidade e clonabilidade do TCR em diferentes estágios do HCC. Identificou segmentos de genes altamente expressos e analisou a frequência das 100 principais sequências CDR3 em tecidos tumorais e amostras de PBMC em diferentes estágios, indicando uma maior clonabilidade do TCR no HCC avançado. Além disso, análises detalhadas das distribuições de frequência de CDR3 e frações de clones revelaram uma diminuição da diversidade e um aumento da clonabilidade nos estágios avançados do HCC, apoiadas por várias medidas quantitativas. No geral, os resultados sugerem um declínio gradual na diversidade das células T com a progressão do HCC nos PBMCs.

Figura 2. Análise de quantificação das sequências CDR3 nos estágios BCLC_A–C em tumores, tecidos adjacentes e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)

3. Comprimento do CDR3 e composição de aminoácidos

As aberrações no comprimento e na composição da região determinante de complementaridade 3 (CDR3) podem impactar significativamente a resposta imune adaptativa de um paciente. Em todas as três fases - dentro do tumor, nos tecidos adjacentes e nas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) - não foi observada diferença significativa na distribuição do comprimento do CDR3. A análise revelou uma menor riqueza de aminoácidos hidrofóbicos nas posições 6 e 7 em pacientes com carcinoma hepatocelular em estágio avançado (HCC), indicando um comprometimento no desenvolvimento e na função de células T autorreativas.

Figura 3. Análise do comprimento do CDR3 e composição de aminoácidos.

4. Comparação dos repertórios de TCR entre pacientes com recaída e sem recaída

Utilizando o método de Kaplan-Meier, a sobrevivência global (OS) foi calculada para os grupos de pacientes BCLC_B e BCLC_C. A mediana da OS foi de 13,0 meses (IC 95% 10,1–15,9) para o estágio BCLC_B e de 5,5 meses (IC 95% 3,2–6,8) para o estágio BCLC_C. A análise da razão de risco revelou disparidades prognósticas distintas entre os diferentes estágios BCLC, com razões de risco mais baixas evidentes para os pacientes do estágio BCLC_C em comparação com os pacientes dos estágios BCLC_A e BCLC_B. Uma análise adicional identificou uma correlação entre uma maior frequência dos 100 principais CDR3 e um prognóstico melhor. Entre os pacientes com recidiva, aqueles com o tumor e PBMC mostraram maior diversidade de TCR em comparação com pacientes não recidivantes, enquanto a frequência de aminoácidos hidrofóbicos era mais baixa em pacientes recidivantes.

Figura 4 (A) Análise de diferenças dos repertórios de TCR em pacientes com recaída e sem recaída. (B) Sobreposição das sequências CDR3 entre pacientes com recaída e sem recaída. (C) Os dados de sequenciamento de TCR mostraram as 100 sequências CDR3 mais prevalentes. (D) Visualização das proporções de clones ocupadas pelas sequências CDR3.

5. Análise do repertório de TCR em um paciente com tumor recidivante

A sequenciação de TCR realizada no tumor original de um paciente recorrente (T1), em tumores recém-desenvolvidos (T2 e T3) e em PBMCs (P1 e P2), revelou um elevado grau de sobreposição de clones de TCR nos PBMCs, potencialmente atribuível a uma abundância da sequência CDR3 CATSDPSTGTTGELFF. Os índices clonais indicaram uma maior clonalidade em P1 do que em P2 e em T1 mais do que em T2 e T3, apesar de diferenças estatisticamente insignificantes. A recombinação dos genes TRBV e TRBJ exibiu uma semelhança elevada entre T1, T2 e T3, sugerindo potenciais variações substanciais nos repertórios de TCR entre tumores primários e recorrentes.

Figura 5. Análise de clonabilidade e diversidade em pacientes com recaída e sem recaída. grupo

Conclusão

A pesquisa elucida as características distintas das sequências do receptor de células T (TCR) em vários tecidos — incluindo tecidos tumorais, tecidos não tumorais adjacentes e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) — em diferentes estágios do sistema de estadiamento do Câncer Hepático Clínico de Barcelona (BCLC). Uma análise longitudinal sistemática de diferentes estágios temporais, combinada com uma análise transversal de amostras diversas, revela a paisagem em mudança das características do TCR durante a progressão do carcinoma hepatocelular (HCC). Notavelmente, a clonabilidade do TCR em células T do sangue periférico demonstra um aumento significativo no estágio BCLC_C em comparação com estágios anteriores, enquanto a diversidade é marcadamente diminuída. Isso indica que os PBMCs podem oferecer uma delimitação mais perspicaz das características do TCR em diferentes estágios tumorais em pacientes com HCC, em comparação com os tecidos tumorais. Nós delineamos claramente uma relação entre as características do TCR e o prognóstico do HCC; pacientes que exibem uma clonabilidade elevada do TCR enfrentam riscos mais baixos de recorrência tumoral, levando assim a prognósticos melhorados. Especulamos que o nível de clonabilidade do TCR em tecidos em estágios iniciais pode ser um marcador preditivo valioso para a recorrência pós-operatória em pacientes.

Referência:

1. Li R, Wang J, Li X, et al. O sequenciamento do receptor de células T revela características imunológicas do carcinoma hepatocelular de acordo com os estágios do câncer de fígado da Clínica de Barcelona, tanto no tecido hepático como no sangue periférico. Ciência do Cancro, 2024, 115(1): 94-108.