Diretrizes para Submissão de Amostras
O que é a Genotipagem APOE?
A genotipagem do APOE é uma técnica molecular utilizada para identificar as variantes genéticas específicas, ou alelos, do gene da Apolipoproteína E (APOE). É uma ferramenta fundamental para investigadores que estudam o metabolismo lipídico e a função neuronal. O gene APOE codifica uma proteína que é o principal transportador de colesterol, tornando-se um alvo central para a investigação básica.
A Biologia dos Alelos APOE: ε2, ε3 e ε4
Os três principais alelos do APOE (ε2, ε3 e ε4) são definidos por alterações de aminoácidos em duas posições-chave (112 e 158). Estas diferenças são causadas por dois polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs): rs429358 e rs7412. Esta variação alélica é o principal motor da investigação funcional sobre o papel da proteína.
| Alelo | SNP chave (rs429358) | SNP chave (rs7412) | Aminoácido em 112 | Aminoácido em 158 |
|---|---|---|---|---|
| ε2 | T | T | Cisteína | Cisteína |
| ε3 | T | C | Cisteína | Arg |
| ε4 | C | C | Arg | Arg |
Por que é que a genotipagem APOE é crítica para a investigação?
Os diferentes isoformas do APOE (E2, E3 e E4) especificadas por estes alelos alteram fundamentalmente a estrutura da proteína. Esta alteração estrutural impacta diretamente a sua capacidade de se ligar a lípidos e interagir com recetores (como a família LDLR).
Compreender esta relação genótipo-fenótipo é crucial para os investigadores que estudam os mecanismos básicos de:
- Transporte e manutenção de lípidos neuronais
- Plasticidade sináptica
- Caminhos de eliminação da amiloide-beta (Aβ)
- Homeostase geral do colesterol
A genotipagem do APOE permite que os investigadores classifiquem com confiança os seus modelos in vitro e in vivo (como iPSCs ou ratos transgénicos), garantindo que os seus dados experimentais sejam robustos, reproduzíveis e corretamente interpretados.
Aplicações de Genotipagem APOE (Apenas para Uso em Pesquisa)
O nosso serviço de genotipagem APOE de alta fidelidade fornece dados fundamentais para uma ampla gama de aplicações de investigação não clínica. Todos os serviços são estritamente para Uso Exclusivo em Investigação (RUO) e não se destinam a uso clínico ou diagnóstico.
Pesquisa sobre Neurodegeneração
O gene APOE é o fator genético mais significativo em estudos sobre o mecanismo da doença de Alzheimer de início tardio (AD). O nosso serviço permite aos investigadores:
- Elucidar os Mecanismos da AβInvestigar como diferentes isoformas do APOE (E2, E3, E4) modulam a eliminação e agregação de peptídeos de beta-amiloide (Aβ) in vitro e in vivo.
- Estudo da Patologia da TauExplore a relação funcional entre o genótipo APOE e o desenvolvimento da fosforilação da Tau e da patologia neuronal associada.
- Modelar a Função SinápticaCaracterizar neurônios ou astrócitos derivados de iPSC para entender como os alelos APOE impactam o transporte de lípidos, a plasticidade sináptica e a saúde neuronal geral.
Metabolismo Lipídico e Investigação Cardiovascular
APOE é um nó central no metabolismo lipídico. A genotipagem é essencial para a pesquisa básica com o objetivo de:
- Compreender a Homeostase do ColesterolEstudando como os isoformas do APOE se ligam de forma diferencial a lípidos e interagem com recetores, como o recetor de lipoproteínas de baixa densidade (LDLR).
- Caracterização de Modelos MetabólicosValidação do background genético de modelos animais utilizados em investigação sobre aterosclerose, dislipidemia e vias metabólicas.
Pesquisa em Farmacogenómica (PGx)
O genótipo APOE pode influenciar vias metabólicas. O nosso serviço apoia a pesquisa fundamental em PGx para:
- Investigar Respostas DiferenciaisCompreender a base genética para as respostas variadas a compostos de investigação em modelos pré-clínicos.
- Apoiar a Descoberta de MedicamentosClassificar linhagens celulares e modelos in vivo para rastrear compostos que possam modular vias relacionadas com o APOE.
Caracterização de Linhagens Celulares e Modelos Animais
A confiança no seu sistema de modelo é fundamental. Antes de iniciar um experimento dispendioso ou prolongado, utilize o nosso serviço rápido para:
- Verificar iPSCs e Linhas CelularesConfirme o genótipo APOE das suas linhas celulares derivadas de humanos (por exemplo, iPSCs, astrócitos, microglia).
- Validar Modelos TransgénicosAssegure a integridade genética das suas colónias de animais knock-in ou transgénicos APOE.
Por que escolher a CD Genomics para o seu genotipagem APOE?
Fornecemos os dados definitivos e prontos para publicação de que precisa para avançar a sua investigação com confiança. Focamo-nos em três vantagens principais: precisão, rapidez e valor.
Precisão Intransigente (Dados Prontos para Publicação)
Fornecemos resultados definitivos e de padrão ouro. A nossa plataforma de qPCR específica para alelos (AS-qPCR) evita a ambiguidade da análise de curva de fusão (HRM), poupando-o de repetições dispendiosas, interpretações erradas e garantindo que os seus dados publicados sejam fiáveis.
Custo-Efetivo e Escalável (Maximize o Seu Orçamento)
Obtenha a precisão de sequenciação a uma fração do custo. A nossa plataforma AS-qPCR validada é altamente eficiente e escalável, oferecendo preços competitivos para estudos de coorte em larga escala, parcerias com CROs e instalações centrais.
Apoio Científico Dedicado (Parceiros na Investigação)
Você não é apenas um número de encomenda. Desde o design inicial do projeto até a interpretação de dados, a nossa equipa de especialistas com doutoramento está disponível para discutir o seu projeto e garantir o seu sucesso.
A Nossa Plataforma de Genotipagem APOE: Precisão que Pode Publicar
O design da nossa plataforma está focado em um objetivo: fornecer um resultado claro e preciso. Alcançamos isso utilizando uma metodologia superior.
O Padrão Ouro: qPCR Específico para Alelos (AS-qPCR)
O nosso serviço utiliza um método de AS-qPCR baseado em sondas com alta discriminação. Esta técnica utiliza primers específicos que apenas amplificam um alvo se o alelo correto (ε2, ε3 ou ε4) estiver presente, combinado com uma sonda fluorescente para confirmação definitiva. O resultado é uma resposta simples e binária "sim/não" para cada alelo, fornecendo dados robustos e fáceis de interpretar.
Por que a AS-qPCR é Superior à Análise de Curva de Derretimento (HRM)
Muitos ensaios comerciais utilizam um método menos preciso chamado Derretimento de Alta Resolução (HRM).
- Ambiguidade em HRM: Este método baseia-se na deteção de pequenas alterações numa curva de derretimento de DNA para diferenciar genótipos. Isto pode ser notoriamente difícil de interpretar e é altamente sensível a dímeros de primers, amplificação não específica ou contaminantes, levando a chamadas ambíguas ou incorretas.
- A nossa vantagem AS-qPCR: O nosso sistema baseado em sondas não é afetado por estes problemas. Não analisa uma curva de fusão; apenas produz um sinal se o alvo correto estiver presente a 100%. Isto proporciona confiança, não complexidade.
O Nosso Fluxo de Trabalho do Serviço de Genotipagem APOE
O nosso processo é concebido para rapidez e precisão do início ao fim.
- Consulta e Submissão de AmostrasContacte os nossos especialistas para discutir o seu projeto. Envie as suas amostras de gDNA, sangue ou swabs utilizando as diretrizes que fornecemos.
- Controlo de Qualidade de Amostras RigorosoTodos os amostras recebidas passam por um rigoroso controlo de qualidade (concentração, pureza) para garantir que são adequadas para análise.
- Genotipagem AS-qPCRAs amostras são analisadas na nossa plataforma AS-qPCR validada em triplicado, com todos os controlos positivos e negativos necessários.
- Análise de Dados e Entrega de RelatóriosA nossa equipa de informática analisa os dados de amplificação, faz a chamada definitiva do genótipo e entrega o seu relatório seguro e abrangente.
Estudo de Caso: 100% de Concordância com Sequenciamento
A nossa metodologia baseia-se em ciência validada, publicada e revisada por pares. A plataforma AS-qPCR que utilizamos foi rigorosamente testada em comparação com o padrão ouro de sequenciação de DNA.
Baseado emLiu, G., et al. "Um método rápido e rentável para genotipagem do polimorfismo do gene da apolipoproteína E." Neurodegeneração Molecular 11, 6 (2016).
DOI10.1186/s13024-016-0069-4
Objetivo do Projeto
Desenvolver e validar um método de genotipagem APOE rápido, de alto rendimento e custo-efetivo que corresponda à precisão do sequenciamento de DNA.
Metodologia
Foi desenvolvido um ensaio de PCR em tempo real específico para alelos (AS-qPCR) para identificar os alelos ε2, ε3 e ε4. Para validar o método, 1.158 amostras de DNA humano foram genotipadas em paralelo utilizando tanto o novo método AS-qPCR quanto o sequenciamento de DNA tradicional.
Resultados
O método AS-qPCR alcançou 100% de concordância em todas as 1.158 amostras quando comparado aos resultados do sequenciamento de DNA padrão-ouro. O método identificou com sucesso e precisão todos os seis possíveis genótipos APOE (por exemplo, ε2/ε3, ε3/ε4, ε4/ε4, etc.).
Conclusão
O estudo confirma que um método baseado em AS-qPCR é uma plataforma extremamente precisa, rápida e robusta para genotipagem de APOE. Esta validação proporciona uma elevada confiança de que o nosso serviço fornece dados equivalentes aos de sequenciação, mas com uma melhoria significativa em termos de rapidez e custo-efetividade para os investigadores.
Legenda da FiguraFig. 3 (Liu et al., 2016): Validação do método AS-qPCR. Os resultados da PCR específica para alelos (cima) mostram 100% de concordância com os resultados de sequenciação de DNA padrão-ouro (embaixo) para os seis genótipos humanos do APOE.
Relatório Genotípico Abrangente
Você receberá um relatório PDF seguro e pronto para publicação contendo:
- Uma chamada de genótipo APOE clara e definitiva (por exemplo, ε3/ε4)
- Um resumo completo da amostra de QC de entrada (concentração, pureza)
- Dados de amplificação bruta (valores Ct) e métricas de qualidade do ensaio
Tipos de Amostras Aceites para Pesquisa
| Tipo de Amostra | Volume / Quantidade Mínima | Notas |
|---|---|---|
| DNA genómico (gDNA) | ≥ 200 ng (a ≥ 10 ng/μL) | Relação OD260/280: 1,8–2,0. Sem degradação. |
| Sangue Total | ≥ 500 μL | Coletar em tubos com EDTA (tampa roxa). |
| Swab Oral (Buccal) | 2 swabs | Utilize o kit de coleta recomendado. |
| Linhas Celulares | ≥ 1 × 10⁶ células | Submeter como pellet congelado. |
Perguntas Frequentes (FAQ)
1. O que é a genotipagem do gene APOE?
A genotipagem do APOE é uma técnica molecular utilizada para identificar as variantes genéticas específicas, ou alelos, do gene da Apolipoproteína E (APOE). Ela determina especificamente a combinação de dois SNPs chave (rs429358 e rs7412), que resultam nos três principais alelos: ε2, ε3 e ε4.
2. Qual é o papel do gene APOE na investigação?
O gene APOE é um foco central de investigação devido ao seu papel crítico no metabolismo lipídico. A proteína que codifica, a Apolipoproteína E, é um transportador primário de colesterol no cérebro e na periferia, tornando-se um alvo de investigação chave para compreender o transporte lipídico, a manutenção neuronal e a plasticidade sináptica.
3. Quais são os alelos APOE ε2, ε3 e ε4?
Os alelos ε2, ε3 e ε4 são as três isoformas principais (versões) do gene APOE. Eles diferem por alterações de um único aminoácido nas posições 112 e 158. Essas diferenças estruturais alteram a capacidade da proteína de se ligar a lipídios e recetores, formando a base para uma extensa investigação sobre as suas consequências funcionais.
4. Qual é o melhor método para genotipagem do APOE?
Embora existam vários métodos, a qPCR específica para alelos (AS-qPCR) e o sequenciamento de ADN são considerados padrões de referência em termos de precisão. A AS-qPCR oferece uma solução altamente sensível, rápida e económica que foi validada para ter 100% de concordância com o sequenciamento, evitando os desafios de interpretação de métodos mais antigos, como a análise da curva de fusão.
5. Qual é a diferença entre genotipagem do APOE e sequenciação?
A genotipagem do APOE é um ensaio direcionado que determina especificamente os alelos conhecidos ε2/ε3/ε4. O sequenciamento do genoma completo ou do exoma, em contraste, analisa o gene inteiro (ou genoma) para todas as variações. Para estudos focados no APOE, a genotipagem é significativamente mais rápida e mais económica.
6. Quais amostras são adequadas para genotipagem do APOE?
A nossa plataforma está validada para uma gama flexível de entradas de pesquisa, incluindo DNA genómico (gDNA), sangue total (preservado em EDTA) e swabs bucais (orais).
Qual é o método mais preciso para a genotipagem do APOE?
7. Por que escolher qPCR específico para alelos em vez da análise de curva de fusão?
A AS-qPCR elimina a ambiguidade da análise HRM ao detectar cada alelo com alta discriminação e especificidade.
Acelere a Sua Pesquisa com Genotipagem Definitiva de APOE
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Referências:
- Validado de acordo com: Liu, G. et al. "Um método rápido e rentável para genotipagem do polimorfismo do gene da apolipoproteína E." Neurodegeneração Molecular 11, 6 (2016).
- Hixson, J. E., & Vernier, D. T. (1990). Isotipagem de restrição da apolipoproteína E humana por amplificação genética e clivagem com HhaI. Revista de Pesquisa em Lipídios, 31(3), 545–548.
- Corder, E. H., et al. (1993). Dose génica do alelo tipo 4 da apolipoproteína E e o risco de doença de Alzheimer em famílias de início tardio.. Ciência, 261(5123), 921–923.
- Mahley, R. W., & Rall, S. C. Jr. (2000). Apolipoproteína E: muito mais do que uma proteína de transporte de lípidos. Revisão Anual de Genómica e Genética Humana, 1, 507–537.
- Eichner, J. E., Dunn, S. T., Perveen, G., Thompson, D. M., Stewart, K. E., & Stroehla, B. C. (2002). Polimorfismo da Apolipoproteína E e doença cardiovascular: uma revisão HuGE. Revista Americana de Epidemiologia, 155(6), 487–495.
