Serviços de Sequenciação de Amplicon: Análise Genética e do Microbioma em Alta Resolução

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

A distribuição da taxonomia de todas as amostras no nível de classificação do Filo.

Mapa de calor da abundância de espécies.

Curva de rarefação das leituras sequenciadas para amostras (A figura acima) & A profundidade das amostras de sequenciação (A figura abaixo).

Análise de boxplot com base em bray Curtis (A), jaccard binário (B), unweighted unifrac (C) e weighted unifrac (D).

Análise PCoA baseada em bray Curtis (A), jaccard binário (B), unifrac não ponderado (C) e unifrac ponderado (D).

Árvore de agrupamento UPGMA.

Proporção média do grupo tratado e do grupo de controlo.

Cladograma.

PONTUAÇÃO LDA.

Perguntas Frequentes sobre Sequenciação de Amplicons

1. Qual é a diferença entre sequenciação direcionada e sequenciação por amplicão?

A sequenciação de amplicons envolve a amplificação por PCR de regiões genómicas específicas seguida de sequenciação, o que garante alta especificidade e taxas de precisão devido ao design preciso dos primers. É particularmente adequada para analisar pequenas regiões definidas do genoma, como na análise de variação genética e perfilagem microbiana. Em contraste, sequenciação direcionada abrange métodos como captura híbrida e enriquecimento baseado em sondas para sequenciar seletivamente regiões genómicas maiores ou múltiplos genes sem amplificação prévia. Isso permite uma análise mais abrangente das áreas selecionadas, mas pode ter taxas de on-target variáveis dependendo da eficiência do processo de enriquecimento. A sequenciação de amplicões, por sua natureza, alcança taxas de on-target superiores em contraste com outros sequenciação direcionada metodologias, atribuindo esta eficiência ao design preciso de primers. Esta abordagem encontra uma aplicabilidade particular em tarefas como genotipagem via sequenciação, bem como o discernimento de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) da linha germinativa, inserções e deleções (indels) e fusões genéticas conhecidas.

2. Quais são as principais aplicações da Sequenciação de Amplicon?

A sequenciação de amplicons serve como uma ferramenta fundamental em diversos domínios científicos, abrangendo, mas não se limitando, às seguintes aplicações:

• Análise de Variância Genética: Revelando polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), inserções, deleções e outras modificações genéticas hereditárias.
• Investigações do Microbioma: Perfilando comunidades microbianas através da sequenciação de genes marcadores como o RNA ribossómico 16S.
• Investigação Oncológica: Identificação de mutações somáticas e modificações genéticas em espécimes tumorais.
• Investigação de Doenças Hereditárias: Explorando as bases genéticas de distúrbios hereditários.
• Inquéritos Ambientais: Avaliação da biodiversidade e identificação de organismos específicos em espécimes ambientais.

3. Qual é a diferença entre Sequenciação de Amplicon e Sequenciação de Genoma Completo (WGS)?

A sequenciação de amplicons visa regiões genómicas específicas, amplificando-as com PCR antes da sequenciação, permitindo uma alta especificidade e profundidade na análise de regiões pequenas e definidas, como na deteção de mutações ou no perfilamento de comunidades microbianas. Em contraste, sequenciação do genoma completo (WGS) sequencia todo o genoma sem seleção ou amplificação prévias, proporcionando uma visão abrangente de toda a informação genética, o que é ideal para descobrir variantes novas e obter um perfil genético completo, mas é mais intensivo em recursos e menos focado em áreas específicas de interesse.

4. Como escolhe as regiões-alvo para a Sequenciação de Amplicons?

A seleção de segmentos-alvo na Sequenciação de Amplicons depende dos objetivos do estudo e da importância biológica desses segmentos. Fatores pertinentes incluem associações com doenças, marcadores genéticos, regiões de variabilidade notável e relevância funcional. Colaborar com bioinformáticos e utilizar bases de dados como dbSNP e ClinVar pode facilitar a identificação precisa das regiões-alvo.

5. Que tipos de análises bioinformáticas podem ser realizadas com dados de Sequenciação de Amplicões?

• Identificação de variantes: Reconhecimento de SNPs, inserções, deleções e diversas variâncias genéticas.
• Análise da diversidade microbiana: Avaliação da constituição e prevalência de consórcios microbianos.
• Investigação filogenética: Pesquisa de conexões evolutivas entre sequências.
• Elucidação funcional: Associar variantes genéticas com implicações funcionais plausíveis.

6. A Sequenciação de Amplicon consegue detetar variantes raras?

Sem dúvida, o Sequenciamento Amplicon apresenta uma sensibilidade notável, permitindo a deteção de variantes infrequentes encontradas em baixas ocorrências. Esta característica torna-o aplicável a situações como a identificação de mutações no câncer e a avaliação da diversidade microbiana.

7. Como é que a CD Genomics garante o sucesso do sequenciamento em regiões com alto conteúdo de GC?

Utilizamos uma estratégia de 3 camadas para maximizar o rendimento e a precisão:

1. Preparação de Biblioteca Optimizada:
   Polimerases adaptativas à metilação reduzem o viés de GC durante a amplificação.
2. Monitorização de QC Aprimorada:
   A deteção em tempo real por nanoporos garante fragmentos intactos e de alta qualidade.
3. Correção em Bioinformática:
   Algoritmos avançados compensam a abundância enviesada por GC nos dados a montante.

Estudos de Caso de Sequenciação de Amplicon

Destaque de Publicação do Cliente

Adaptação microbiana e resposta a altas concentrações de amónia e precipitados durante a digestão anaeróbia em condições psicrófilas e mesofílicas.

Diário: Pesquisa em Água

Publicado: 1 de Outubro de 2021

DOI: Desculpe, mas não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei o prazer de traduzi-lo.

Fundo

Altas concentrações de amónia (TAN >1,5 g/L) são uma das principais causas da inibição do metano na digestão anaeróbia (DA), particularmente em condições mesofílicas (37°C) e psicrofílicas (22,6°C). Os precipitados de fosfato (por exemplo, estruvite) agravam ainda mais o colapso do sistema, reduzindo o rendimento de metano em mais de 50%. Este estudo é pioneiro na exploração dos mecanismos de adaptação microbiana à amónia em reatores psicrofílicos e analisa o impacto a longo prazo dos precipitados nas comunidades metanogénicas.

Objetivos do Projeto

1. Adaptação MicrobianaDescobrir as respostas microbianas a altos níveis de TAN (4.000 mg/L) em AD psicrófilo vs. mesofílico.
2. Identificação do Consórcio PrincipalIdentificar metanógenos tolerantes ao amoníaco e táxons sensíveis ao precipitado.
3. Dinâmicas FuncionaisLigar as alterações metagenómicas às vias de metabolismo do metano.

Serviços da CD Genomics

Como parceiro central em genómica, a CD Genomics forneceu:

1. Sequenciação de Amplicões de rRNA 16S
   Plataforma: Illumina MiSeq PE300
   Região-alvo: V4-V5 hipervariável (otimizada para deteção de Arqueias).
   Primers: 515F (5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA) / 926R (5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT).
   Profundidade de Dados: ~30.000 leituras/amostra (cobrindo todas as fases de adaptação TAN).
2. Genoma Completo Sequenciação Metagenómica
   Plataforma: Illumina NovaSeq PE150.
   Profundidade: 6 GB de dados brutos/amostra (amostras iniciais vs. amostras finais).
   Padrões de ADN: Concentração ≥50 ng/μL, razão 260/280 <1.8.
3. Análise Bioinformática
   Pipeline: MG-RAST v4.0.3.
   Taxonomia: SILVA (classificação 16S), GenBank (classificação de metagenomas).
   Anotação Funcional: Bases de dados KEGG/Subsistemas (e-value ≤10⁻²⁵, 90% de identidade).
   Métricas de Diversidade: Índice de Shannon, PCoA (distância de Bray-Curtis).

Principais Conclusões

1. Adaptação à Amónia em Reator Psicrofílico
   • Mudança Dominante de Metanógenos:
     • A TAN >3 g/L, Methanocorpusculum atingiu 71% de abundância relativa (dados de metagenoma), tornando-se o metanógeno hidrogenotrófico dominante (Fig. 5a).
     • O consórcio bacteriano mudou para Enterococcaceae (Firmicutes), aumentando de 0,1% para 80% de abundância (Fig. 4a).
   • Resiliência Funcional:
     • A análise KEGG revelou genes de metabolismo de metano aumentados (por exemplo, conversão de compostos metílicos) sob altas concentrações de TAN (Fig. 8).
2. Colapso Induzido por Precipitados em Reatores Mesofílicos
   • Rendimento de Metano: Diminuiu em mais de 50% após a formação de precipitados, sem recuperação em 50 dias.p<0,05).
   • Depleção de Metanógenos:
     • Os genes de metanogénicos anotados foram reduzidos de >300.000 para <2.500 ocorrências (dados de metagenoma, Fig. 5b).
     • Substituição de Espécies: Methanosarcina barkeri deslocado M. mazei como o arqueão dominante tolerante ao amónio (Fig. 4b).
3. α Diversidade como Indicador de Estabilidade
   • Reator Psicrófilo: A diversidade diminuiu em 40% (Índice de Shannon) após a adaptação bem-sucedida ao amoníaco (Fig. 3a).
   • Reactor Mesofílico: A diversidade estável mascarou a falha funcional, evidenciada pela persistente diminuição de metano (Fig. 3b).

Figuras Referenciadas

Figura 3. Diversidade alfa e rendimento de metano em reatores experimentais a diferentes concentrações de amónia (a) reator psicrófilo (R1-CO) e (b) reator mesofílico (R2-WW).

Figura 4. Perfis de Bactérias e Arqueias a partir de dados de amplicão de 16S rRNA juntamente com o aumento passo a passo nos níveis de amónia.

Figura 5. (a) Abundância relativa do Domínio Archaea, e (b) número de ocorrências para os Domínios Bactérias e Archaea em AD psicrófilo (R1-CO) e mesofílico (R2-WW).

Figura 8. Número de cópias de genes para o metabolismo do metano (anabolismo e catabolismo) utilizando a Base de Dados KEGG.

Implicações

1. Otimização de ProcessosEnriquecedor Methanocorpusculum em AD psicrófila aumenta a tolerância ao amónio, reduzindo as necessidades de energia para aquecimento.
2. Mitigação de RiscoA precipitação de estruvite causa inibição metanogénica irreversível, necessitando de monitorização em tempo real de fosfato/pH.
3. Recurso Biotecnológico: M. barkeri e Methanocorpusculum servem como candidatos para o desenvolvimento de inoculantes resistentes ao amoníaco.