Serviço de EM-seq

Metilação do DNA é fundamental na regulação da expressão génica, influenciando uma ampla gama de processos biológicos, incluindo desenvolvimento, envelhecimento e várias doenças como o câncer. À medida que a investigação em genómica avança, a procura por métodos de deteção de metilação do DNA mais eficientes e precisos intensifica-se. O EM-seq (sequenciação de metilação enzimática) surge como uma nova tecnologia de análise de metilação do DNA, liderando a análise de metilação precisa com vantagens inovadoras. Oferece soluções sem precedentes com sensibilidade e precisão aumentadas, além de requisitos mínimos de entrada de DNA.

Na CD Genomics, aproveitamos o poder da tecnologia EM-seq para oferecer serviços excepcionais de análise de metilação, permitindo que explore as complexidades da regulação genética e os mecanismos subjacentes a várias doenças. Nesta página de serviços abrangente, iremos aprofundar os principais aspetos do EM-seq, as suas vantagens tecnológicas, áreas de aplicação e como fornecemos suporte avançado adaptado às suas necessidades de investigação.

Introdução à Tecnologia EM-seq

EM-seq é uma tecnologia de sequenciação de metilação de DNA baseada em enzimas que distingue entre citosina não metilada (C) e 5-metilcitosina (5mC) metilada utilizando métodos enzimáticos. Ao contrário do método tradicional de conversão com bisulfito (WGBS), o EM-seq emprega catálise enzimática para converter citosinas não metiladas em uracilo (U), mantendo as citosinas metiladas inalteradas. Durante a amplificação e sequenciação subsequentes, o uracilo é reconhecido como timina (T). Esta abordagem permite a deteção precisa de locais de metilação.

Comparação da Conversão Enzimática e da Conversão com Bisulfito

O método convencional de conversão com bisulfito é eficaz para detetar a metilação. No entanto, requer condições de reação severas que frequentemente danificam o ADN, limitando a sua aplicação em amostras de ADN de baixo input. O EM-seq ultrapassa essas questões ao preservar a integridade do ADN, permitindo processar uma gama mais ampla de amostras, incluindo amostras de ADN em traços e frágeis, como o ADN tumoral circulante (ctDNA).

Princípio Experimental

O EM-seq oferece uma solução abrangente e robusta para identificar regiões de metilação no genoma humano. Durante a preparação da biblioteca, é empregue uma conversão enzimática única, causando muito menos dano ao DNA e exigindo entradas de amostra menores, resultando em bibliotecas de maior qualidade e melhor desempenho. O design personalizado de sondas de metilação da Twist fornece sondas eficazes e especializadas para o enriquecimento direcionado de CpG. Reagentes de hibridização otimizados adicionam flexibilidade aos tempos de trabalho e melhoram as taxas de precisão.

A sequenciação por metilação envolve métodos enzimáticos ou químicos que convertem a citosina não metilada em uracilo através da desaminação, enquanto a citosina metilada permanece intacta. Durante a amplificação, a adenina complementar emparelha-se com o uracilo na cadeia complementar, introduzindo a timina na posição da citosina não metilada original. O produto final da sequência é assimétrico, produzindo duas moléculas de DNA de cadeia dupla diferentes após a conversão. Para o DNA metilado, o processo resulta em um padrão de sequência alternativo, ilustrando a distinção entre regiões metiladas e não metiladas nas sequências de DNA.

Figura 1. O sequenciamento de metilação envolve métodos enzimáticos ou químicos.

Na fase inicial da reação, a Dioxygenase de Translocação Ten-Eleven 2 (TET2) desempenha um papel crucial na transformação de citosinas metiladas, como 5-metilcitosina (5mC) e 5-hidroximetilcitosina (5hmC), em 5-carboxicitosina (5caC). Isso é ainda potenciado por um impulsionador de oxidação, a 5-glucosilhidroximetilcitosina (5ghmC). Estas reações servem como mecanismos de proteção, protegendo 5mC e 5hmC de atividades de desaminação subsequentes.

Antes da desaminação das citosinas em uracilo pela enzima APOBEC, o DNA sofre desnaturação para se preparar para reações posteriores. A amplificação subsequente por reação em cadeia da polimerase (PCR) transforma 5mC ou 5hmC modificados em citosina e converte uracilo em timina. Após a PCR, a sequência de ácido nucleico reflete a das sequências convertidas por bisulfito, garantindo a compatibilidade do EM-seq com fluxos de trabalho analíticos existentes, incluindo ferramentas como Bismark e bwa-meth.

Eficiência da Conversão Enzimática

Vantagens da EM-seq

A EM-seq supera o método tradicional de conversão com bisulfito em vários aspetos chave, particularmente ao trabalhar com quantidades mínimas de DNA. Aqui estão algumas das principais vantagens da tecnologia EM-seq:

1. Baixo Input de DNA e Alta SensibilidadeUm dos principais benefícios do EM-seq é a sua capacidade de obter dados de sequenciação de alta qualidade a partir de quantidades mínimas de DNA. Ao contrário do WGBS, o EM-seq causa menos danos ao DNA, permitindo a sequenciação com apenas 10 ng de DNA. Esta característica é inestimável para a análise de amostras raras ou preciosas, como o DNA tumoral circulante (ctDNA) no plasma, que geralmente são de baixa concentração e peso molecular.

2. Fragmentos de Biblioteca Mais Longos e CompletosComparado com o WGBS, o EM-seq gera fragmentos de DNA mais longos e mais intactos, minimizando lacunas de sequenciação. Isso aumenta a abrangência da informação de metilação em todo o genoma, particularmente em regiões que são difíceis de sequenciar, ao reduzir efetivamente os pontos cegos de sequenciação causados por fragmentos de DNA curtos.

3. Uniformidade Superior na Cobertura do GCRegiões de DNA ricas em conteúdo de GC frequentemente apresentam desafios na sequenciação devido a potenciais enviesamentos que podem afetar a precisão. O EM-seq destaca-se nesta área, garantindo uma cobertura uniforme tanto em áreas ricas em GC como em áreas ricas em AT, evitando assim o enviesamento de cobertura de GC comum no WGBS. Esta característica é crucial para analisar com precisão os estados de metilação em todo o genoma.

4. Detecção de Ilhas CpG Mais PrecisaA EM-seq é particularmente eficaz na deteção de ilhas CpG. A profundidades de sequenciação equivalentes, a EM-seq pode revelar mais locais CpG, muitos dos quais podem ser ignorados pelos métodos tradicionais de WGBS. Esta capacidade é particularmente significativa para a triagem precoce de doenças como o câncer, onde as alterações de metilação em ilhas CpG podem servir como marcadores precoces da doença.

Aplicações do EM-seq

No atual panorama científico em rápida evolução, a tecnologia EM-seq emergiu como uma ferramenta poderosa com amplas aplicações em vários campos. A sua capacidade de detectar amostras de DNA em baixas concentrações e estudar alterações na metilação do DNA torna-a particularmente valiosa. Aqui está como o EM-seq está a transformar áreas-chave de investigação e desenvolvimento:

• Desvendando o Cancro Precoce: Rastreio e Biópsias LíquidasA EM-seq desempenha um papel crucial na deteção precoce e monitorização contínua de doenças, ao identificar marcadores de metilação de cfDNA em fluidos corporais como plasma e urina.
• Mergulhando na EpigenéticaEsta técnica ajuda a descobrir como a metilação do DNA influencia a expressão génica e os processos biológicos, lançando luz sobre as variações epigenéticas em diferentes estados biológicos.
• Precisão na Análise de Amostras de TraçoQuer se tratem de amostras preciosas como oócitos, espermatócitos ou embriões, o EM-seq fornece informações de metilação com alta precisão, mesmo a partir de amostras minúsculas.
• Descoberta Pioneira de BiomarcadoresA EM-seq é fundamental na seleção e validação de marcadores de metilação relacionados a processos biológicos específicos, apoiando esforços futuros de investigação e desenvolvimento.
• Insights Genómicos e Epigenéticos sobre DoençasAo decifrar o papel da metilação do DNA, o EM-seq contribui significativamente para a nossa compreensão dos mecanismos biológicos, fornecendo informações sobre processos de doenças complexas.
• Aprimoramento do Desenvolvimento de MedicamentosA tecnologia é utilizada para estudar como os medicamentos afetam os padrões de metilação do DNA, oferecendo dados moleculares críticos que facilitam a triagem e otimização de fármacos.
• Explorando a Biodiversidade e a EvoluçãoA EM-seq analisa padrões de metilação em diferentes espécies ou populações, ajudando a descobrir mudanças adaptativas e os mecanismos genéticos que as governam.
• Análise da Metilação do Local de Início de TranscriçãoAvalia com precisão o estado de metilação nos locais de início de transcrição (TSS), destacando-se particularmente em regiões ricas em GC, para revelar os seus papéis regulatórios na expressão génica.

Comparação de Plataformas para Análise de Metilação de DNA

Fluxo de Trabalho EM-seq

A interação com os nossos serviços proporciona uma experiência fluida, adaptada para oferecer resultados de alta qualidade para os seus projetos de EM-seq. Aqui está como garantimos a excelência em cada etapa:

Passo 1: Extração de DNAComeçamos por extrair meticulosamente DNA genómico de alta qualidade das suas amostras. Este primeiro passo crítico garante que o DNA está intacto e livre de quaisquer contaminantes, estabelecendo uma base sólida para análises posteriores.

Passo 2: Preparação da BibliotecaUtilizando tecnologias de preparação de bibliotecas de última geração, preparamos habilmente as suas amostras de DNA para sequenciação EM-seq. Este processo é crucial para garantir que as suas amostras estejam otimizadas para resultados precisos.

Passo 3: SequenciaçãoA sua biblioteca de ADN é então sequenciada utilizando as mais recentes tecnologias de sequenciação de nova geração (NGS). Esta fase permite-nos capturar dados de metilação abrangentes em todo o genoma, proporcionando uma visão ampla da paisagem epigenética.

Passo 4: Análise de DadosA nossa equipa de bioinformática especializada elabora um relatório de análise de dados detalhado para si. Este relatório abrange níveis de metilação, identificação de regiões diferencialmente metiladas e deteção de ilhas CpG, permitindo-lhe extrair informações acionáveis dos seus dados.

Figura 1. A sequenciação de metilação envolve métodos enzimáticos ou químicos.

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra Tipos de amostras: Tecidos, células e fluidos corporais de pacientes com cancro. Entre as amostras de fluidos corporais, o plasma é recomendado em vez do soro para minimizar a interferência do cfDNA derivado de linfócitos. Volume da Amostra: Tecido > 50 mg; células > 2×106plasma > 5 mL, soro > 10 mL. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciamento Plataforma: Plataformas de sequenciação de alto rendimento, como a série Illumina HiSeq. Profundidade de cobertura: ≥ 30x. Pontuação de qualidade: Mais de 80% das bases com uma pontuação de qualidade ≥Q30.
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: 1. Estatísticas de Alinhamento de Genomas 2. Avaliação Geral do Nível de Metilação 2.1 Distribuição do Nível de Metilação CpG 2.2 Cobertura de Metilação CpG 3. Estatísticas de Locais de Metilação e Comparação Entre Amostras 3.1 Análise de Correlação do Nível de Metilação 3.2 Análise de Componentes Principais (PCA) dos Níveis de Metilação 3.3 Análise de Agrupamento dos Níveis de Metilação 4. Análise de Locais de Metilação Diferencial 4.1 Anotação de Locais de Metilação Diferencial 4.2 Visualização de Locais de Metilação Diferencial 4.3 Análise de Enriquecimento de Locais de Metilação Diferencial 5. Análise de Regiões de Metilação Diferencial 5.1 Anotação de Locais de Metilação Diferencial 5.2 Visualização de Locais de Metilação Diferencial 5.3 Análise de Enriquecimento de Locais de Metilação Diferencial Nota: Os dados de saída e os conteúdos de análise recomendados apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Dados de Sequenciação Originais
• Resultados Experimentais
• Relatório de Análise de Dados
• Perfilagem de Metilação Detalhada

O EM-seq, como uma tecnologia revolucionária de sequenciação de metilação de DNA, supera o método tradicional de conversão com bisulfito com as suas vantagens em baixo input de DNA, alta sensibilidade e cobertura uniforme de GC, fornecendo dados de metilação de maior qualidade e mais precisos para vários campos de investigação. Na CD Genomics, estamos comprometidos em fornecer aos nossos clientes os serviços de EM-seq mais avançados para ajudá-lo na exploração aprofundada da regulação genética, mecanismos de doenças, investigação do câncer e outras áreas.

Quer esteja a realizar investigação básica ou a desenvolver ferramentas de diagnóstico avançadas, os serviços de EM-seq podem fornecer um excelente apoio à sua pesquisa. Sinta-se à vontade para nos contactar para saber mais sobre o EM-seq ou solicitar um orçamento, e deixe que esta tecnologia avançada o ajude a alcançar novas descobertas científicas.

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Histograma de Distribuição de Metilação CpG

Histograma de Cobertura de CpG

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Vulcão de Locais Diferencialmente Metilados

Mapa de Calor de Locais Diferencialmente Metilados

Análise de Enriquecimento KEGG de Regiões Diferencialmente Metiladas

Perguntas Frequentes sobre EM-seq

O que deve ser observado ao extrair gDNA ou cfDNA?

Ao extrair DNA genómico (gDNA) ou DNA livre de células (cfDNA), recomenda-se alcançar o seguinte:

• Requisito de gDNATotal ≥20 ng, Concentração ≥2 ng/μl
• Requisito de cfDNATotal ≥20 ng, Concentração ≥2 ng/μl

Além disso, é crucial evitar o uso de EDTA ou EB como solventes para o seu gDNA/cfDNA extraído, uma vez que estes componentes podem afetar negativamente a eficiência enzimática.

Que precauções devem ser tomadas ao separar soro ou plasma?

Ao separar soro ou plasma:

• Evitar Congelação e DescongelaçãoAs amostras de sangue total não devem passar por ciclos de congelamento e descongelamento.
• Processamento OportunoPrepare plasma ou soro o mais rapidamente possível após a colheita de sangue.
• Condições de ArmazenamentoO soro ou plasma pode ser armazenado a -80°C para manter a integridade. Ciclos repetidos de congelamento e descongelamento devem ser evitados para preservar a qualidade da amostra.

Como é calculada a taxa de conversão de amostras?

Durante a preparação da biblioteca de metilação, a conversão teórica assume que todas as citosinas não metiladas (C) são convertidas em timinas (T) (originalmente convertidas em uracilo (U), e depois em T durante a PCR). No entanto, nem todos os locais podem ser convertidos, e o estado de metilação do DNA é inicialmente desconhecido. Portanto, as taxas de conversão reais não podem ser determinadas diretamente a partir do DNA da amostra.

Para abordar isto, o DNA lambda (DNA de bacteriófago), que contém apenas citosina não metilada, é utilizado como um controlo negativo com um estado de metilação conhecido. Ao incorporar o DNA lambda na preparação da biblioteca, processamento e sequenciação juntamente com o DNA da amostra, a taxa de conversão do DNA lambda é calculada para servir como um indicador da taxa de conversão geral da amostra.

Estudos de Caso EM-seq

Análise de Sequenciação Epigenética Multimodal (MESA) de DNA Livre de Células para Detecção Não Invasiva de Câncer

Revista: Medicina Genómica
Fator de impacto: 7,324
Publicado: 16 de janeiro de 2024

Fundo

A metilação do DNA livre de células (cfDNA) emergiu como um biomarcador promissor para a deteção precoce de cancro, superando as limitações das abordagens baseadas em alterações genéticas. A Methyl-seq Enzimática (EM-seq) melhora a sequenciação tradicional com bisulfito ao preservar a integridade do DNA, permitindo uma análise epigenética multimodal que aumenta a precisão na deteção do cancro.

Materiais e Métodos

Resultados

A MESA (Análise de Sequenciamento Epigenético Multimodal) demonstrou um desempenho forte na deteção de câncer colorretal ao integrar múltiplas características epigenéticas do cfDNA. As principais conclusões incluem:

1. Análise de Metilação:

• A metilação do cfDNA sozinha distinguiu amostras de câncer de amostras não cancerígenas com alta precisão (AUC = 0,8663 para a coorte 1 e AUC = 0,8293 para a coorte 2).
• As amostras de cancro mostraram níveis de metilação mais elevados em locais CpG-alvo, consistente com a hipermetilação do promotor em tumores.

A metilação diferencial de cfDNA entre amostras de câncer e não câncer permite uma deteção precisa do câncer.

2. Perspectivas sobre a Organização do Nucleossoma:

• A MESA capturou efetivamente a ocupação e a imprecisão dos nucleossomas, revelando diferenças estruturais chave entre amostras cancerígenas e normais.
• Os locais de poliadenilação foram incluídos na análise pela primeira vez, fornecendo novas informações sobre a organização da cromatina relacionada ao câncer.

Informação sobre a organização do nucleossoma a partir de EM-seq direcionado de cfDNA.

3. Detecção de Cancro Usando Características de Nucleossomas:

• A ocupação de nucleossomas por si só alcançou AUCs de 0,8494 (coorte 1) e 0,9213 (coorte 2).
• A inclusão de dados sobre o local de poliadenilação melhorou ainda mais a precisão na deteção do câncer.
• A difusão dos nucleossomas, uma nova métrica que captura a heterogeneidade da cromatina, forneceu um poder preditivo adicional.

4. Integração Multimodal para Aumento da Precisão:

• A combinação de metilação, ocupação de nucleossomas, difusão e WPS melhorou o desempenho da classificação.
• O modelo multimodal superou consistentemente os modelos de características únicas em diferentes estágios de cancro e coortes.

Deteção precisa de cancro com base na ocupação de nucleossomas e difusão.

5. Validação Cruzada de Coortes:

• A MESA foi robusta em diferentes coortes, mantendo uma alta precisão preditiva.
• A abordagem era adaptável a outros métodos de sequenciação sem bisulfito (por exemplo, cfDNA TAPS) e foi eficaz na deteção de cancros hepatocelulares e pancreáticos.

Conclusão

A MESA integra múltiplas modalidades epigenéticas, melhorando a precisão de deteção para cânceres colorretal, hepático e pancreático, validada em quatro coortes. Representa um grande avanço na deteção não invasiva do câncer ao aproveitar perfis epigenéticos abrangentes de cfDNA.

Referência:

1. Li, Y., Xu, J., Chen, C. et al.Análise de sequenciação epigenética multimodal (MESA) de DNA livre de células para deteção não invasiva de câncer colorretal. Medicina Genómica dezasseis, 9 (2024). Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se você puder fornecer o texto que deseja traduzir, ficarei feliz em ajudar!