RNA-Seq

A CD Genomics tem fornecido serviços de RNA-Seq (sequenciação de RNA) precisos e acessíveis há décadas. Nós combinamos ambos Illumina (leitura curta) e PacBio plataformas de long reads para obter o transcriptoma que permite a montagem de novo ou re-sequenciamento para bactériasplantas, animais e humanos.

O que é RNA Seq?

RNA-Seq, uma ferramenta fundamental que utiliza Sequenciação de Nova Geração (NGS) tecnologias, é projetado para criar mapas detalhados e quantificações do transcriptoma, desmascarando informações como níveis de transcrição de genes, a estrutura e expressão de transcritos, modificação de RNA e RNA não codificante, entre outros aspetos. O transcriptoma, uma coleção abrangente de todos os transcritos numa célula, oferece informações vitais sobre os níveis de transcritos em estágios de desenvolvimento ou estados fisiológicos específicos. Compreender o transcriptoma é essencial para interpretar os elementos funcionais do genoma, bem como para entender o desenvolvimento biológico e as doenças. Os principais objetivos da transcriptómica incluem catalogar todas as espécies de transcritos; identificar a estrutura transcricional dos genes; e quantificar os níveis de expressão de cada transcrito sob diferentes condições.

Ao oferecer uma visão imparcial e de alta resolução dos padrões de transcrição global, o RNA-Seq introduz um método económico e preciso para a quantificação da expressão génica e análise da expressão génica diferencial em múltiplos grupos de amostras. Permite a identificação de transcritos novos e previamente não previstos, independentemente de um genoma de referência, facilitando assim a montagem de novo de transcriptomas não estudados. Além disso, permite a descoberta de novas arquiteturas génicas, isoformas alternativamente splicing, fusões génicas, SNP/InDel e expressões específicas de alelos (ASE).

Vantagens do RNA-Seq

• Medições quantitativas e precisas de moléculas de RNA com resolução de um único par de bases
• Descoberta de novos transcritos, variantes de splicing e fusões genéticas
• Notavelmente, esta estratégia é aplicável a qualquer espécie, independentemente da disponibilidade do genoma de referência.
• Uma prática que oferece custos comparáveis ou até inferiores em relação a muitas outras metodologias.
• A abordagem detecta habilmente vários tipos de RNA, abrangendo mRNAmiRNA, lncRNA, entre outros, oferecendo uma visão abrangente sobre o RNA presente nas células ou tecidos.
• Destaque-se a capacidade de analisar simultaneamente múltiplas amostras, acumulando eficientemente uma abundância de dados—uma característica que sublinha a sua profunda utilidade na análise de RNA em alta capacidade.

Desenvolvimento de RNA-Seq

A tecnologia de sequenciação passou por transformações e avanços significativos ao longo do tempo, especialmente nas últimas duas a três décadas. Inicialmente, Sequenciação de Sanger foi instituído como o método de sequenciação de primeira geração. Ao aproveitar reações de síntese de terminação reversível em química binária, a sequenciação de Sanger possibilitou a determinação das sequências de bases nos terminais de DNA de acordo com a sequência de RNA. A década de 1990 marcou avanços notáveis na tecnologia de sequenciação, coincidindo com o início dos projetos de sequenciação do genoma completo. Introdução de sequenciação de alto rendimento plataformas, como a sequenciação 454, Sequenciação Illumina, e a sequenciação Ion Torrent, facilitaram a viabilidade da sequenciação de RNA. As tecnologias tradicionais de sequenciação de RNA frequentemente exigiam um volume substancial de células para obter uma quantidade satisfatória de RNA para sequenciação, o que ofuscava a heterogeneidade entre diferentes células. Em essência, estas técnicas revelam as características de expressão génica de distintos tipos e estados celulares.

As aplicações do RNA-Seq

A sequenciação de RNA (RNA-seq) é uma técnica amplamente utilizada, aplicável em vários domínios da investigação biológica e médica. Abaixo estão delineadas várias aplicações comuns do RNA-seq:

• Análise da expressão génica
• Análise de expressão gênica diferencial
• Descoberta de novos genes
• Análise de splicing alternativo
• Biomarcador descoberta
• Pesquisa em RNA não codificante
• Elucidação da função do gene
• Genética populacional e biologia evolutiva

De facto, com os avanços tecnológicos, o alcance das aplicações de RNA-seq continua a expandir-se incessantemente.

Fluxo de Trabalho de RNA-Seq

A CD Genomics combina tanto o Illumina HiSeq como Sistemas PacBio fornecer uma análise de RNA-Seq e bioinformática rápida e precisa para qualquer espécie. A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais. O fluxo de trabalho geral para RNA-Seq está descrito abaixo.

Especificação do Serviço

	Requisitos e preparação da amostra Quantidade de RNA ≥ 2 μg, concentração de RNA ≥ 50 ng/μl, OD260/280=1.8~2.0 Todas as amostras de RNA são validadas quanto à pureza e quantidade.
Clique	Sequenciação Illumina HiSeq PE150 Estudo de expressão gênica diferencial: Illumina HiSeq 50 Transcrição completa: PacBio SMRT Mais de 80% das bases com um score de qualidade ≥Q30
	Análise Bioinformática Fornecemos análises de bioinformática personalizadas, incluindo: Estatísticas de profundidade de sequenciamento e cobertura Assemblagem de novo e mapeamento de genoma de referência Anotações genéticas e níveis de expressão génica Predição de RNA novo e identificação de variantes Teste para expressão diferencial de genes Avaliação da expressão específica de alelos Identificação de loci de traço quantitativo de expressão (eQTLs)

Pipeline de análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciamento originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em RNA-Seq para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece um pacote completo de serviços de sequenciação de RNA, incluindo padronização de amostras, construção de bibliotecas, sequenciação profunda, controlo de qualidade de dados brutos, montagem de genomas e análise bioinformática personalizada. Podemos adaptar este fluxo de trabalho ao seu interesse de pesquisa. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, sinta-se à vontade para nos contactar.

Referências:

1. Marguerat S, Bähler J. RNA-seq: da tecnologia à biologia. Ciências da vida celulares e moleculares, 2010, 67: 569-579.
2. Hrdlickova R, Toloue M, Tian B. Métodos de RNA-Seq para análise do transcriptoma. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA, 2017, 8(1): e1364.
3. Saliba A E, Westermann A J, Gorski S A, et al. RNA-seq de célula única: avanços e desafios futuros. Pesquisa em ácidos nucleicos, 2014, 42(14): 8845-8860.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciamento

Distribuição A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

1. Quantos replicados biológicos preciso para cada condição?

Sugerimos que submeta pelo menos 3 réplicas por amostra para aumentar a confiança e reduzir o erro experimental. Note que isto serve apenas como uma diretriz, e o número final de réplicas será determinado por si com base nas suas condições experimentais finais.

2. Quais são as vantagens do NGS em relação ao Microarray?

Várias tecnologias foram desenvolvidas para a análise do transcriptoma, como microarranjo e NGS. Comparado com microarray, o NGS tem várias vantagens, incluindo:

i. RNA-Seq é uma ferramenta sensível para o perfilamento da expressão génica. Comparado com microarrays, o RNA-Seq oferece uma leitura digital que é mais precisa para toda a expressão génica.

ii. A microarray pode oferecer apenas informações limitadas sobre a expressão génica (ou seja, os genes incorporados no chip), enquanto o NGS é uma abordagem mais abrangente que fornece informações adicionais sobre variantes génicas novas e transcritos de baixa abundância.

iii. O NGS produz resultados muito mais reprodutíveis e fiáveis do que o microarray. Não é necessário realizar qPCR após o RNA-Seq, enquanto que é um procedimento padrão para microarranjo para verificar resultados.

3. Quando é necessário eliminar rRNA antes da sequenciação?

O RNA ribossómico (rRNA) constitui mais de 90% do RNA total. Realizar RNA-Seq sem enriquecer para poli-A ou sem depletar rRNA resultará em leituras que se originam predominantemente do rRNA. Por exemplo, menos de um décimo das leituras conteria informações úteis. Transcritos de transcriptomas com rRNA depletado são convencionalmente considerados como RNA total, englobando mRNA e RNA não codificante. Consequentemente, o enriquecimento em poli-A ou a depleção de rRNA é essencial para qualquer plataforma de sequenciação.

4. Qual é o pipeline convencional para a análise de dados de RNA-Seq?

O pipeline convencional para dados de RNA-Seq inclui controlo de qualidade dos dados brutos, alinhamento, montagem, perfilagem da expressão génica e outras análises.

Figura 1. Visão geral da análise de dados de RNA-Seq (Kukurba e Montgomery 2015).

A distinção entre Sequenciação de DNA e o sequenciamento de RNA decorre das suas diferentes capacidades analíticas. O sequenciamento de DNA permite-nos compreender a composição dos genes dentro do genoma de um organismo, discernir as suas funções e obter um conhecimento abrangente das relações intergénicas. Por outro lado, o sequenciamento de RNA aperfeiçoa a nossa compreensão dos mecanismos biológicos e das alterações que ocorrem nos processos vitais. Isso é alcançado através do estudo dos níveis de expressão, diversidade e mecanismos regulatórios.

A sequenciação de RNA visa especificamente as moléculas de RNA, revelando a estrutura e função do transcriptoma e identificando variações na expressão génica. No processo, as moléculas de RNA são transcritas para os seus correspondentes de DNA complementar (conhecidos como cDNA), que são então sequenciados. Os componentes comuns da sequenciação de RNA geralmente incluem a sequenciação do transcriptoma completo, análise de expressão diferencial, entre outros.

Referência:

1. Kukurba K R, Montgomery S B. Sequenciação e análise de RNA. Protocolos de Cold Spring Harbor, 2015(11): pdb. top084970.

A caracterização do transcriptoma por sequenciação de RNA identifica uma grande subdivisão molecular e clínica na leucemia linfocítica crónica.

Revista: Pesquisa Genómica
Fator de impacto: 11,92
Publicado: online a 21 de novembro de 2013

Resumo

Os autores realizaram sequenciação profunda de RNA em diferentes subpopulações de linfócitos B normais e células de leucemia linfocítica crónica (LLC) de uma coorte de 98 pacientes. Detectaram milhares de elementos transcricionais que foram diferencialmente expressos entre as células B normais e as células de LLC ou que exibem padrões de splicing específicos da LLC. Também identificaram uma subdivisão molecular e clínica importante na LLC.

Métodos

Resultados

1. O panorama da expressão génica da LLC

Os autores encontraram 1089 genes expressos de forma diferencial entre as células B normais e as células CLL (Tabela 1). Como era de esperar, os genes mais expressos de forma diferencial são imunoglobulinas devido à clonalidade das células CLL. As análises de vias revelaram que os genes envolvidos em vias metabólicas apresentaram uma expressão mais elevada em CLL, enquanto os genes relacionados ao spliceossoma, proteassoma e ribossoma foram substancialmente regulados para baixo em CLL.

Tabela 1. Diferenças de expressão e splicing entre os diferentes grupos analisados.

Figura 1. Paisagem transcricional da LLC. (A) O potencial codificante de genes expressos de forma diferencial entre as amostras de LLC e normais. (B) Expressão normalizada de elementos transponíveis (ETs). (C) Genes com razões de splicing específicas da condição. (D) Expressão específica de alelos de mutações somáticas.

2. A paisagem de splicing da LLC

Os autores identificaram 2000 genes com diferenças significativas nas proporções relativas de isoformas de splicing alternativo entre as células CLL e normais, incluindo genes com isoformas alternativas bem conhecidas como biomarcadores de cancro, como RAC1, CD44 e BCL2L1. Alterações na via BCR foram identificadas a nível de expressão e a nível de splicing (Figura 2).

Figura 2. Alterações de splicing na via BCR entre amostras normais (N) e tumorais (T).

3. Quimeras transcripcionais na LLC

As fusões genéticas que levam a proteínas quiméricas constituem um mecanismo importante de carcinogénese. Os autores identificaram 122 junções quiméricas presentes exclusivamente em células de LLC com análise de RNA-seq. Selecionaram duas quimeras (a junção quimérica FCRL2-FCRL3 e a junção quimérica GAB1-SMARCA5) para validação adicional por PCR e sequenciação de Sanger.

Figura 3. Junções quiméricas entre FCRL2-FCRL3 e GAB1-SMARCA5.

4. Identificação de dois principais subgrupos transcricionais de LLC

A clusterização hierárquica das amostras de RNA-seq com base na expressão génica separou claramente as células normais das amostras tumorais (Figura 4A). A clusterização revelou dois grandes subgrupos, fortemente definidos, dentro das amostras de CLL, o que foi ainda mais suportado por escalonamento multidimensional e análise de componentes principais.

Figura 4. Principais subgrupos transcricionais de LLC. (A) Agrupamento de amostras de LLC e normais. (B) Agrupamento de consenso. (C) Escalonamento multidimensional de amostras de LLC e normais com base na expressão génica. (D&E) Gráfico de pontuação de enriquecimento.

5. Relevância clínica dos grupos CLL C1 e C2

Os autores avaliaram o impacto clínico dos grupos CLL C1 e C2. Comparados com os pacientes C1, os pacientes C2 apresentaram uma maior frequência de mutações em genes relacionados a desfechos adversos e eram mais propensos a estarem no estágio avançado de Binet.

Figura 5. Comportamento clínico dos subgrupos C1 e C2.

Conclusão

Identificámos a expressão diferencial de milhares de elementos transcricionais entre a LLC e as células B normais, abrangendo genes codificadores de proteínas, RNAs não codificantes e pseudogenes. Além disso, a maioria dos genes apresentou padrões de splicing específicos da LLC. Através da análise de agrupamento dos dados de sequenciação de RNA, discernimos dois subgrupos moleculares, C1 e C2, intimamente relacionados com características biológicas clínicas e duração do tratamento. Investigações subsequentes sugeriram que a ativação do recetor de células B (BCR) no microambiente dos gânglios linfáticos pode ser a origem das diferenças entre C1 e C2.

Referência:

1. Ferreira P G, Jares P, Rico D, et al. A caracterização do transcriptoma por sequenciação de RNA identifica uma grande subdivisão molecular e clínica na leucemia linfocítica crónica. Pesquisa genómica, 2014, 24(2): 212-226.