Diretrizes para Submissão de Amostras
A CD Genomics tem fornecido serviços de RNA-Seq (sequenciação de RNA) precisos e acessíveis há décadas. Nós combinamos ambos Illumina (leitura curta) e PacBio plataformas de long reads para obter o transcriptoma que permite montagem de novo ou re-sequenciação para bactérias, plantas, animais e humanos.
O que é RNA Seq?
RNA-Seq, uma ferramenta fundamental que utiliza Sequenciação de Nova Geração (NGS) tecnologias, é projetado para criar mapas detalhados e quantificações do transcriptoma, desmascarando informações como níveis de transcrição de genes, a estrutura e expressão de transcritos, modificação de RNA e RNA não codificante, entre outros aspetos. O transcriptoma, uma coleção abrangente de todos os transcritos numa célula, oferece informações vitais sobre os níveis de transcritos em estágios de desenvolvimento ou estados fisiológicos específicos. Compreender o transcriptoma é essencial para interpretar os elementos funcionais do genoma, bem como para entender o desenvolvimento biológico e as doenças. Os principais objetivos da transcriptómica incluem catalogar todas as espécies de transcritos; identificar a estrutura transcricional dos genes; e quantificar os níveis de expressão de cada transcrito sob diferentes condições.
Ao oferecer uma visão imparcial e de alta resolução dos padrões de transcrição globais, o RNA-Seq introduz um método económico e preciso para a quantificação da expressão génica e análise da expressão génica diferencial em múltiplos grupos de amostras. Permite a identificação de transcritos novos e anteriormente não previstos, independentemente de um genoma de referência, facilitando assim a montagem de novo de transcriptomas não estudados. Além disso, permite a descoberta de novas arquiteturas génicas, isoformas alternativamente splicing, fusões génicas, SNP/InDel e expressões específicas de alelos (ASE).
Vantagens do RNA-Seq
- Medições quantitativas e precisas de moléculas de RNA com resolução de um único par de bases
- Descoberta de novos transcritos, variantes de splicing e fusões genéticas
- Notavelmente, esta estratégia é aplicável a qualquer espécie, independentemente da disponibilidade do genoma de referência.
- Uma prática que oferece custos comparáveis ou até inferiores em relação a muitas outras metodologias.
- A abordagem detecta habilmente vários tipos de RNA, abrangendo mRNA, miRNA, lncRNA, entre outros, oferecendo uma visão abrangente sobre o RNA presente em células ou tecidos.
- Destaque-se a capacidade de analisar simultaneamente múltiplas amostras, acumulando de forma eficiente uma abundância de dados — uma característica que sublinha a sua profunda utilidade em análises de RNA de alto rendimento.
Desenvolvimento de RNA-Seq
A tecnologia de sequenciação passou por transformações e avanços significativos ao longo do tempo, particularmente nas últimas duas a três décadas. Inicialmente, Sequenciação de Sanger foi instituído como o método de sequenciação de primeira geração. Ao aproveitar reações de síntese de terminação reversível em química binária, a sequenciação de Sanger possibilitou a determinação de sequências de bases nos terminais de DNA de acordo com a sequência de RNA. A década de 1990 marcou avanços notáveis na tecnologia de sequenciação, coincidindo com o início dos projetos de sequenciação de genomas completos. Introdução de sequenciação de alto rendimento plataformas, como a sequenciação 454, Sequenciação Illumina, e a sequenciação Ion Torrent, facilitaram a viabilidade da sequenciação de RNA. As tecnologias tradicionais de sequenciação de RNA frequentemente exigiam um volume substancial de células para obter uma quantidade satisfatória de RNA para sequenciação, o que ofuscava a heterogeneidade entre diferentes células. Em essência, estas técnicas revelam as características de expressão génica de distintos tipos e estados celulares.
As aplicações do RNA-Seq
A sequenciação de RNA (RNA-seq) é uma técnica amplamente utilizada, aplicável em vários domínios da investigação biológica e médica. Abaixo estão delineadas várias aplicações comuns do RNA-seq:
- Análise da expressão génica
- Análise de expressão gênica diferencial
- Descoberta de novos genes
- Análise de splicing alternativo
- Biomarcador descoberta
- Pesquisa sobre RNA não codificante
- Elucidação da função dos genes
- Genética populacional e biologia evolutiva
De facto, com os avanços tecnológicos, o alcance das aplicações de RNA-seq continua a expandir-se incessantemente.
RNA-Seq em Lote vs Transcriptómica Resolvida em Células
O RNA-Seq em grande escala fornece comparações robustas e rentáveis da expressão génica ao nível da amostra.
Para estudos onde a heterogeneidade dos tecidos é importante, uma abordagem resolvida por células pode ajudar a separar sinais mistos e revelar alterações na população/estado.
Escolha com base em se a sua pergunta é uma mudança a nível de amostra ou uma visão a nível celular.
| Fator de decisão | RNA-Seq em massa (nível de amostra) | Transcriptómica resolvida por célula (a nível celular / baseada em núcleos) |
|---|---|---|
| O que medes | Expressão média por amostra | Expressão em resolução celular (heterogeneidade) |
| Melhor para | DEGs, vias, mudanças globais | Populações/estados celulares, sinais raros, alterações na composição |
| Entradas típicas | Compatibilidade ampla (ARN de tecido/células) | Frequentemente necessita de preparação viável de células. ou preparação baseada em núcleos + controlo de qualidade extra |
| Bioinformática | QC padrão → contagens → DE → enriquecimento | QC mais complexo → agrupamento → anotação → marcadores |
| Sensibilidade à heterogeneidade | Sinais mistos podem ocultar mudanças opostas. | Projetado para separar populações mistas |
| Custo/esforço | Inferior | Mais alto |
- Escolha RNA-Seq em massa se a sua pergunta central for: "Quais genes/caminhos mudam entre condições?"
- Escolha a transcriptómica resolvida por células se a sua questão central for: "Quais populações celulares impulsionam a mudança e como é que os estados mudam?"
Um caminho intermédio: RNA-Seq em massa + desconvolução computacional
Quando existem perfis de referência adequados, a deconvolução pode estimar tendências de composição celular a partir da expressão em massa—útil quando experimentos em resolução celular não são viáveis.
Fluxo de Trabalho de RNA-Seq
A CD Genomics combina tanto o Illumina HiSeq como Sistemas PacBio fornecer uma análise de RNA-Seq e bioinformática rápida e precisa para qualquer espécie. A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais. O fluxo de trabalho geral para RNA-Seq está descrito abaixo.
Escolha a Sua Estratégia de RNA-Seq
Diferentes questões de pesquisa e tipos de amostras exigem diferentes estratégias de RNA-Seq. Abaixo estão as opções mais comuns para o perfilamento do transcriptoma, desde a enriquecimento direcionado de mRNA até uma cobertura total de RNA mais ampla e resolução de isoformas de leitura longa.
RNA-Seq Focado em mRNA (Enriquecimento de Poly(A))
- Melhor paraquantificação da expressão génica, expressão diferencial, análise de vias, triagem de fusões/variantes em transcritos codificadores
- Considerações: não é ideal quando o RNA está altamente degradado, ou quando RNAs não poliadenilados são centrais para o estudo.
- O que você vai recebermatriz de expressão + DEGs + saídas prontas para enriquecimento (opcionais)
RNA-Seq Total (Depleção de rRNA)
- Melhor paracobertura de transcriptoma mais ampla, incluindo RNAs não codificantes; amostras onde a seleção de poli(A) não é preferida
- Considerações: requer uma remoção robusta de rRNA e controlo de qualidade para garantir leituras informativas
- O que você vai receber: saídas de expressão codificante + não codificante; descoberta opcional de RNAs/variantes novos (dependente do projeto)
Perfilagem de Isoformas de Comprimento Completo (Opção de Leitura Longa)
- Melhor paradescoberta de isoformas, splicing alternativo, anotação de transcritos, caracterização de fusões genéticas
- Como é utilizado: frequentemente emparelhado com RNA-Seq de leituras curtas para quantificação + resolução de isoformas
- O que você vai recebermodelos de transcritos completos, anotações a nível de isoforma, gráficos de resumo prontos para publicação (quando aplicável)
Explorar Sequenciamento de Transcritos de Comprimento Total (Iso-Seq)
Design comumRNA-Seq de leitura curta para quantificação robusta + perfilagem de isoformas de leitura longa para clareza na estrutura do transcrito e splicing.
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Especificações do Serviço: Requisitos de Amostra, Sequenciação e Análise Bioinformática
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Pipeline de análise
Entregáveis
- Os dados de sequenciamento originais
- Resultados experimentais
- Relatório de análise de dados
- Detalhes em RNA-Seq para a sua escrita (personalização)
Explore Mais Serviços de Sequenciação de RNA
Para além do transcriptoma RNA-Seq, oferecemos ensaios de sequenciação de RNA especializados para RNA não codificante, regulação da tradução, interações hospedeiro-microbio e RNA de baixo input ou extracelular.
Sequenciação de RNA pequeno
Perfilar populações de miRNA/siRNA/piRNA para estudos de RNA regulatório.
Sequenciação de circRNA
Identificar e quantificar RNAs circulares para explorar mecanismos de retro-splicing e regulação.
Perfilagem de Ribossomas (Ribo-seq)
Medir a atividade de tradução através de fragmentos protegidos por ribossomas.
Sequenciamento de RNA dual
Capturar simultaneamente os transcriptomas do hospedeiro e do patógeno para estudar interacções.
Sequenciação de RNA Exossomal
Perfil de RNA de vesículas para descoberta de biomarcadores e estudos de sinalização (RUO).
RNA-Seq de Entrada Ultra-Baixa
Projetado para amostras raras/preciosas e quantidades limitadas de RNA.
Sequenciação Degradoma (PARE)
Mapear a clivagem mediada por miRNA e validar alvos (casos de uso focados em plantas comuns).
Sequenciação de Cauda poliA (TAIL-seq)
Quantificar o comprimento da cauda poli(A)/características da extremidade 3' ligadas à estabilidade do mRNA e à tradução.
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A CD Genomics oferece um pacote completo de serviços de sequenciação de RNA, incluindo padronização de amostras, construção de bibliotecas, sequenciação profunda, controlo de qualidade de dados brutos, montagem de genomas e análise bioinformática personalizada. Podemos adaptar este fluxo de trabalho ao seu interesse de pesquisa. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.
Referências:
- Marguerat S, Bähler J. RNA-seq: da tecnologia à biologia. Ciências da vida celulares e moleculares, 2010, 67: 569-579.
- Hrdlickova R, Toloue M, Tian B. Métodos de RNA-Seq para análise do transcriptoma. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA, 2017, 8(1): e1364.
- Saliba A E, Westermann A J, Gorski S A, et al. RNA-seq de célula única: avanços e desafios futuros. Pesquisa em ácidos nucleicos, 2014, 42(14): 8845-8860.
Resultados da Demonstração
Os resultados parciais estão apresentados abaixo:
Distribuição da qualidade de sequenciamento
Distribuição de A/T/G/C
Interface do Navegador IGV
Análise de Correlação Entre Amostras
Gráfico de Pontuação PCA
Diagrama de Venn
Gráfico de Volcano
Resultados Estatísticos da Anotação GO
Classificação KEGG
Perguntas Frequentes sobre RNA-Seq
1. Quantos replicados biológicos preciso para cada condição?
Sugerimos que submeta pelo menos 3 réplicas por amostra para aumentar a confiança e reduzir o erro experimental. Note que isto serve apenas como uma diretriz, e o número final de réplicas será determinado por si com base nas suas condições experimentais finais.
2. Quais são as vantagens do NGS em relação ao Microarray?
Várias tecnologias foram desenvolvidas para a análise do transcriptoma, como microarray e NGS. Comparado com microarray, o NGS tem várias vantagens, incluindo:
i. A RNA-Seq é uma ferramenta sensível para o perfil de expressão génica. Comparado com microarray, a RNA-Seq oferece uma leitura digital que é mais precisa para toda a expressão génica.
ii. A microarray só pode oferecer informações limitadas sobre a expressão génica (ou seja, os genes incorporados no chip), enquanto o NGS é uma abordagem mais abrangente que fornece informações adicionais sobre variantes génicas novas e transcritos de baixa abundância.
iii. O NGS produz resultados muito mais reproduzíveis e fiáveis do que os microarrays. Não é necessário realizar qPCR após o RNA-Seq, enquanto é um procedimento padrão para microarranjo para verificar resultados.
3. Quando é necessário eliminar rRNA antes da sequenciação?
O RNA ribossómico (rRNA) constitui mais de 90% do RNA total. Realizar RNA-Seq sem enriquecer para poly-A ou sem depletar rRNA resultará em leituras que se originam predominantemente de rRNA. Por exemplo, menos de um décimo das leituras conteria informação útil. Os transcritos de transcriptomas depletados de rRNA são convencionalmente considerados como RNA total, abrangendo mRNA e RNA não codificante. Consequentemente, o enriquecimento em poli-A ou a depleção de rRNA é essencial para qualquer plataforma de sequenciação.
4. Qual é o pipeline convencional para a análise de dados de RNA-Seq?
O pipeline convencional para dados de RNA-Seq inclui controlo de qualidade dos dados brutos, alinhamento, montagem, perfilagem da expressão génica e outras análises.
Figura 1. Visão geral da análise de dados de RNA-Seq (Kukurba e Montgomery 2015).
A distinção entre Sequenciação de DNA e o sequenciamento de RNA decorre das suas diferentes capacidades analíticas. O sequenciamento de DNA permite-nos compreender a composição dos genes dentro do genoma de um organismo, discernir as suas funções e obter um conhecimento abrangente das relações intergénicas. Por outro lado, o sequenciamento de RNA aprimora a nossa compreensão dos mecanismos biológicos e das alterações que ocorrem nos processos vitais. Isso é alcançado através do estudo dos níveis de expressão, diversidade e mecanismos regulatórios.
A sequenciação de RNA visa especificamente as moléculas de RNA, revelando a estrutura e função do transcriptoma e identificando variações na expressão génica. No processo, as moléculas de RNA são transcritas para os seus correspondentes em DNA complementar (conhecidos como cDNA), que são então sequenciados. Os componentes comuns da sequenciação de RNA incluem geralmente a sequenciação do transcriptoma completo, a análise de expressão diferencial, entre outros.
Referência:
- Kukurba K R, Montgomery S B. Sequenciação e análise de RNA. Protocolos de Cold Spring Harbor, 2015(11): pdb. top084970.
Estudos de Caso de RNA-Seq
A caracterização do transcriptoma por sequenciação de RNA identifica uma importante subdivisão molecular e clínica na leucemia linfocítica crónica.
Revista: Pesquisa do Genoma
Fator de impacto: 11,92
Publicado: online a 21 de novembro de 2013
Resumo
Os autores realizaram sequenciação profunda de RNA em diferentes subpopulações de linfócitos B normais e células de leucemia linfocítica crónica (LLC) de uma coorte de 98 pacientes. Detectaram milhares de elementos transcricionais que foram diferencialmente expressos entre as células de LLC e os linfócitos B normais ou exibiram padrões de splicing específicos da LLC. Também identificaram uma subdivisão molecular e clínica importante na LLC.
Métodos
- Bioanalisador 2100
- Bibliotecas de RNA-seq
- bibliotecas de cDNA
- Sequenciação Illumina
- Média Multi-array Robusta (RMA)
- Quantificações de genes, transcritos e exões:
- Programa do Capacitor de Fluxo
- Método de Ward
- A distância 1-r
- Escalonamento Multidimensional
- SPSS Statistics 20.0
- Método de Kaplan e Meier
- Análise multivariada
Resultados
1. O panorama da expressão génica da LLC
Os autores encontraram 1089 genes expressos de forma diferencial entre as células B normais e as células CLL (Tabela 1). Como era de esperar, os genes mais expressos de forma diferencial são imunoglobulinas devido à clonalidade das células CLL. As análises de vias revelaram que os genes envolvidos em vias metabólicas apresentaram uma expressão mais elevada em CLL, enquanto os genes relacionados com o spliceossoma, proteassoma e ribossoma foram substancialmente regulados em baixa em CLL.
Tabela 1. Diferenças de expressão e splicing entre os diferentes grupos analisados.
Figura 1. Paisagem transcricional da LLC. (A) O potencial codificante de genes expressos de forma diferencial entre as amostras de LLC e normais. (B) Expressão normalizada de elementos transponíveis (ETs). (C) Genes com razões de splicing específicas da condição. (D) Expressão específica de alelos de mutações somáticas.
2. O panorama de splicing da LLC
Os autores identificaram 2000 genes com diferenças significativas nas proporções relativas de isoformas de splicing alternativo entre as células CLL e normais, incluindo genes com isoformas alternativas bem conhecidas como biomarcadores de cancro, como RAC1, CD44 e BCL2L1. Alterações na via BCR foram identificadas a nível de expressão e a nível de splicing (Figura 2).
Figura 2. Alterações de splicing na via BCR entre amostras normais (N) e tumorais (T).
3. Quimeras transcripcionais na LLC
As fusões gênicas que levam a proteínas quiméricas constituem um importante mecanismo de carcinogénese. Os autores identificaram 122 junções quiméricas presentes exclusivamente em células de LLC com análise de RNA-seq. Eles selecionaram duas quimeras (a junção quimérica FCRL2-FCRL3 e a junção quimérica GAB1-SMARCA5) para validação adicional por PCR e sequenciação de Sanger.
Figura 3. Junções quiméricas entre FCRL2-FCRL3 e GAB1-SMARCA5.
4. Identificação de dois principais subgrupos transcricionais de LLC
A clusterização hierárquica das amostras de RNA-seq com base na expressão génica separou claramente as células normais das amostras tumorais (Figura 4A). A clusterização revelou dois grandes subgrupos, fortemente definidos, dentro das amostras de CLL, o que foi ainda mais suportado pela escalonagem multidimensional e pela análise de componentes principais.
Figura 4. Principais subgrupos transcricionais de LLC. (A) Agrupamento de amostras de LLC e normais. (B) Agrupamento de consenso. (C) Escalonamento multidimensional de amostras de LLC e normais com base na expressão génica. (D&E) Gráfico de pontuação de enriquecimento.
5. Relevância clínica dos grupos CLL C1 e C2
Os autores avaliaram o impacto clínico dos grupos CLL C1 e C2. Em comparação com os pacientes C1, os pacientes C2 apresentaram uma maior frequência de mutações em genes relacionados a desfechos adversos e eram mais propensos a estar no estágio avançado de Binet.
Figura 5. Comportamento clínico dos subgrupos C1 e C2.
Conclusão
Identificámos a expressão diferencial de milhares de elementos transcricionais entre a LLC e as células B normais, abrangendo genes codificadores de proteínas, RNAs não codificantes e pseudogenes. Além disso, a maioria dos genes apresentou padrões de splicing específicos da LLC. Através da análise de agrupamento dos dados de sequenciação de RNA, discernimos dois subgrupos moleculares, C1 e C2, intimamente relacionados com características biológicas clínicas e duração do tratamento. Investigações subsequentes sugeriram que a ativação do receptor de células B (BCR) no microambiente do linfonodo pode ser a origem das diferenças C1/C2.
Referência:
- Ferreira P G, Jares P, Rico D, et al. A caracterização do transcriptoma por sequenciação de RNA identifica uma grande subdivisão molecular e clínica na leucemia linfocítica crónica. Pesquisa genómica, 2014, 24(2): 212-226.
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