Sequenciação de RNA Exossomal

A CD Genomics oferece aos investigadores de exossomas um serviço abrangente para investigar informações sobre RNA associado a exossomas.

A Introdução da Sequenciação de RNA Exossomal

Os exossomas são vesículas derivadas de células que estão presentes em muitos e talvez em todos os fluidos eucarióticos, incluindo sangue, urina e meio de cultura de culturas celulares. Uma vez libertados, os exossomas viajam por todo o corpo, fundem-se com outras células e transferem a sua carga para a célula aceitadora. Pesquisas recentes revelaram evidências de que os exossomas desempenham um papel importante na comunicação intercelular e na transmissão de doenças.

Figura 1. Biogénese e identificação de exossomas. (Kalluri et al., 2020)

A CD Genomics oferece aos clientes um serviço abrangente de sequenciamento de RNA exossomal. Os exossomas contêm subconjuntos distintos de microARNs, mARNs, lncARNs e outros ncARNs. A evidência está a acumular-se de que a entrega de miRNA através da transmissão exossomal pode resultar em RNA longo totalmente funcional ou traduzível dentro de uma célula recetora. Os miARNs exossomais podem ter funções importantes na comunicação célula-célula e têm potencial como biomarcadores para detetar e monitorizar doenças. A perfuração de RNA exossomal fornece informações sobre a função do RNA associado aos exossomas e permite as aplicações mostradas abaixo.

• A identificação de alterações no miRNA exossomal em estados de doença é considerada um método fiável para descobrir assinaturas de sequência para o diagnóstico e prognóstico da doença.
• A identidade e o nível de expressão do mRNA exossomal têm sido considerados uma abordagem valiosa para descobrir biomarcadores a partir de amostras de biofluidos como sangue, saliva e urina.
• Os RNAs longos não codificantes (lncRNA) também estão presentes em exossomas e podem apresentar padrões de expressão que são distintos do nível celular.

Vantagens da Sequenciação de RNA Exossomal

• Amostragem Não InvasivaAs amostras de RNA são obtidas a partir de vesículas extracelulares em fluidos corporais como sangue, urina e saliva, eliminando a necessidade de procedimentos invasivos. Esta abordagem reduz o desconforto do paciente, minimiza riscos e melhora a adesão do paciente.
• Estabilidade RobustaO RNA encerrado dentro de vesículas extracelulares está protegido pelas membranas das vesículas, tornando-o mais estável em comparação com o RNA livre, sendo assim menos suscetível à degradação por enzimas de RNA. Esta maior estabilidade simplifica o manuseio e armazenamento de amostras, reforçando, em última análise, a fiabilidade dos dados.
• Diversidade e RiquezaO RNA exossomal abrange vários tipos de moléculas de RNA, incluindo mRNA, miRNA e lncRNA, fornecendo uma riqueza de dados de expressão genética que reflete estados fisiológicos celulares autênticos e alterações patológicas.
• Reflexão Celular em Tempo RealOriginários de células vivas, os vesículos extracelulares oferecem informações em tempo real sobre as condições fisiológicas e patológicas celulares. Consequentemente, o sequenciamento de RNA exossomal pode ser utilizado para monitorizar o início da doença, a progressão e os resultados do tratamento.
• Alta Sensibilidade e EspecificidadeAs técnicas de sequenciação de RNA exossomal apresentam uma sensibilidade notável, capaz de detetar moléculas de RNA em baixa abundância. Além disso, a especificidade das vesículas, proveniente de diversas origens celulares, permite um diagnóstico precoce de doenças e uma tipificação precisa através da sequenciação de RNA.
• Aplicações DiversificadasA sequenciação de RNA exossomal possui um vasto potencial em diversos estudos de doenças, incluindo cancro, doenças neurodegenerativas, doenças cardiovasculares e além. A sua utilidade abrange o diagnóstico precoce de doenças, a avaliação do prognóstico, o monitoramento do tratamento e a descoberta de novos biomarcadores.
• Facilitando Cuidados de Saúde PersonalizadosAtravés da sequenciação de RNA exossomal, podem ser obtidos perfis de expressão genética personalizados. Quando integrados com outras informações moleculares, isso pode abrir caminho para a personalização de estratégias de tratamento individualizadas, aumentando a eficácia terapêutica e minimizando reações adversas.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de RNA Exossomal

A CD Genomics fornece RNA exossomal de ponta a ponta. NGS serviço incluindo a isolação de exossomas de soro, plasma, urina, meios de cultura de tecidos ou outras amostras e a extração do seu RNA associado utilizando kits comerciais. O serviço de NGS exossomal da CD Genomics combina bibliotecas codificadas por código de barras da NGS da Illumina e sequenciação de próxima geração plataformas, oferecendo dados de sequenciação profunda da mais alta qualidade para acelerar a sua pesquisa sobre RNA exossomal.

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra RNA total ≥ 100 ng, Concentração ≥ 20 ng/µL Supernatantes celulares ≥ 15 mL Soro, plasma ≥ 1 mL Relação OD A260/A280 ≥ 1,8, relação A260/230 ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar livres de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são indicados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciação As opções de serviço flexíveis incluem HiSeq 4000, HiSeq X ten e NextSeq 500, MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400. Volume de dados de sequenciação: 10 Gb
	Análise de Dados Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: QC de dados brutos Alinhamento e quantificação baseada em TPM/RPKM/FPKM Análise de expressão Estatísticas de SNPs/Indels Análise de splicing alternativo anotação GO e KEGG Nota: Os dados de saída e os conteúdos de análise recomendados exibidos são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na sequenciação de RNA exossomal para a sua escrita (personalização)

A conferência de sequenciação de RNA exossomal da CD Genomics foca nas ligações entre a variação celular nos tecidos e a função dos órgãos, além de elucidar as origens das doenças. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, sinta-se à vontade para contacte-nos.

Referência:

1. Kalluri R, LeBleu V S. A biologia, função e aplicações biomédicas dos exossomas. Science, 2020, 367(6478): eaau6977.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciação

Distribuição A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

1. Qual é a função do exossoma no RNA?

O exossoma funciona como um jogador fundamental no metabolismo do RNA, envolvido de forma intrincada nos mecanismos de degradação e processamento do RNA. Operando como um complexo exorribonuclease de RNA dentro das células eucarióticas, o exossoma é dedicado à vigilância e degradação de uma variedade de espécies de RNA. Este papel crucial é primordial para sustentar o equilíbrio do RNA celular, orquestrando padrões de expressão génica e coordenando respostas a fatores de stress celular. Além disso, os exossomas participam em vias de vigilância do RNA, supervisionando meticulosamente a garantia de qualidade dos transcritos de RNA antes da tradução.

2. Que espécies de RNA estão nos exossomas?

Quanto às espécies de RNA encapsuladas dentro de exossomas, elas abrangem uma rica variedade, incluindo RNA mensageiro (mRNA), microRNA (miRNA), RNA longo não codificante (lncRNA), RNA de transferência (tRNA) e vários RNAs não codificantes menores. Protegidas pela membrana de bicamada lipídica dos vesículos, estas moléculas de RNA residem dentro dos exossomas, resguardadas de degradação rápida. A presença de determinadas espécies de RNA dentro dos exossomas depende de variáveis como o tipo celular, o meio fisiológico e os estados patológicos. Significativamente, estes RNAs exossomais têm a capacidade de serem transferidos para células receptoras, onde exercem influência sobre padrões de expressão génica e funções celulares tanto em contextos normais como patológicos.

3. Qual método de preparação de biblioteca devemos escolher: de baixo input ou padrão?

Quando a quantidade de RNA extraído excede 100ng, é aconselhável empregar o método padrão de depleção de rRNA, utilizando 100ng de RNA para a preparação da biblioteca de transcritos totais. Geralmente, uma maior quantidade de template durante a preparação da biblioteca resulta em uma maior cobertura de informação genética. A abordagem de preparação de biblioteca de baixo input é utilizada quando a quantidade de amostra é limitada; no entanto, sempre que possível, métodos convencionais de preparação de biblioteca são preferidos para procedimentos experimentais.

4. Relativamente aos estudos de exossomas, devemos usar plasma ou soro?

A recomendação inclina-se para o uso de plasma devido à propensão à ativação de plaquetas durante a coagulação na coleta de soro, levando à geração de um número significativo de exossomas e outras vesículas. Consequentemente, as vesículas obtidas a partir do soro são consistentemente mais numerosas em comparação com as do plasma, com mais de 50% das vesículas originárias de plaquetas. Assim, o plasma serve como um meio superior para investigar exossomas em condições fisiológicas patológicas. A maioria das amostras de pesquisa de exossomas circulantes utiliza plasma.

5. Quais são as principais considerações para o sequenciamento de RNA de exossomas?

No contexto do sequenciamento de RNA de exossomas, várias considerações críticas merecem atenção:

Qualidade da AmostraGarantir a qualidade da amostra de origem e a conformidade com os procedimentos de recolha padronizados.

Pureza de ExossomasImplementação de métodos de extração eficientes para garantir a pureza e integridade dos exossomas.

Qualidade do RNAO RNA extraído deve apresentar excelente integridade e pureza para evitar degradação.

Plataforma TecnológicaSeleção de uma plataforma de sequenciação apropriada para garantir a precisão e fiabilidade dos dados.

Análise de Dados: Envolver uma equipa de análise bioinformática competente para garantir a rigorosidade científica e a robustez da análise de dados.

6. Qual é o método de construção de bibliotecas?

A CD Genomics normalmente prepara bibliotecas de cDNA de fita, com rRNA eliminado, a partir de RNA total livre de DNA.

Nanovesículas de exossomas derivados de carne de porco cozinhada mediando distúrbios metabólicos - o microRNA pode ser o culpado.

Revista: Revista de Nanobiotecnologia
Fator de impacto: 11,509
Publicado: 09 de março de 2023

Resumo

Vesículas extracelulares (EVs), incluindo exossomas e ectossomas, representam estruturas envoltas em lípidos liberadas por todos os tipos de células. Os exossomas, tipicamente variando de 40 a 160 nm de diâmetro, atuam como mediadores cruciais da comunicação intercelular e têm potencial como marcadores diagnósticos para doenças como o câncer, Parkinson e Alzheimer. Abrangendo lípidos, proteínas e microRNAs (miRNAs), os miRNAs exossomais derivados de fontes dietéticas podem ser absorvidos e exercer funções biológicas fundamentais dentro dos organismos. Esta investigação procura caracterizar exossomas e perfis de miRNA extraídos de carne de porco cozida utilizando sequenciação de alto rendimento, elucidando o seu impacto na fisiologia murina. Destaca a resiliência dos exossomas e miARNs sob condições térmicas elevadas e sublinha a importância dietética da carne de porco como um componente nutricional primário.

Materiais e Métodos

Resultados

A equipa de investigação submeteu inicialmente vários tecidos de porco (tecido adiposo, músculo, fígado) a uma cozedura minuciosa em água, seguida da extração dos seus exossomas utilizando ultracentrifugação diferencial. A análise do extrato sob microscopia eletrónica de transmissão (MET) e microscopia de força atómica (MFA) revelou nanovesículas semelhantes a exossomas. Uma análise adicional utilizando dispersão de luz dinâmica (DLD) indicou que 80% das partículas variavam entre 20-200nm, com um tamanho médio de 70,29nm. A citometria de fluxo subsequente revelou taxas positivas de 84,5% para os marcadores específicos de exossomas CD63 e 95,9% para CD81. Estes resultados de caracterização confirmam a extração bem-sucedida de exossomas a partir de tecidos de porco cozinhados.

Fig. 1. Identificação de exossomas isolados de carne cozinhada.

Na análise de sequenciação de alto rendimento, observou-se que os exossomas derivados de diferentes tecidos apresentam variações nos tipos e quantidades de miARNs que contêm. No conteúdo exossomal do músculo de porco cozido (PMEx), miR-1, miR-133a-3p e miR-206 constituem coletivamente 80% do total de miARNs. Curiosamente, nos exossomas do fígado de porco cozido (PLEx), miR-122 predomina, representando 37,8% do total de miARNs, enquanto nos exossomas do tecido adiposo de porco cozido (PFEx), miR-125b é notavelmente abundante.

Fig 2. Os ratos receberam água potável suplementada com PME.

Após a administração dos exossomas extraídos a ratos durante um período, foram feitas várias observações notáveis: (1) foi observado um aumento significativo no peso corporal; (2) os níveis de miR-1, miR-133a-3p, miR-206 e miR-99a no sangue aumentaram de forma acentuada, com uma elevação sustentada observada durante o experimento de inversão das vilosidades intestinais; (3) a presença de vacúolos e gotas lipídicas nos tecidos hepáticos; (4) os níveis de glicose em jejum aumentaram significativamente e a taxa de consumo diminuiu após a injeção de glicose em jejum. Os resultados experimentais confirmam que o CM-Exo pode ser absorvido pelos intestinos e entrar nos corpos dos ratos, influenciando o peso corporal, os níveis de miRNA no sangue e participando em processos regulatórios biológicos, como a tolerância à glicose, a sinalização endócrina da glicose e o metabolismo lipídico hepático.

Fig 3. Visão geral das alterações transcriptómicas do fígado de rato.

A análise do transcriptoma de amostras de fígado de rato identificou 446 genes diferencialmente expressos (DEGs), com 292 genes regulados para cima e 174 regulados para baixo. As análises de enriquecimento GO e KEGG indicaram que esses DEGs estão predominantemente envolvidos no metabolismo de esteroides. Subsequentemente, foi construída uma rede regulatória putativa de miRNA-mRNA-metabolismo de lípidos, revelando uma interconexão significativa entre miRNA exossomal e vias metabólicas lipídicas hepáticas.

Fig 4. 100 principais genes hub identificados a partir da rede PPI; rede regulatória de vias de metabolismo de miRNA–mRNA–lipídios.

Conclusão

Vesículas extracelulares, ou exossomas, têm atraído uma atenção significativa na biologia celular devido às suas potenciais aplicações terapêuticas e diagnósticas. Inicialmente vistas como mero desperdício celular, agora entendemos que as suas funções vão muito além da eliminação de resíduos. Os exossomas representam um novo modo de comunicação celular, contribuindo para uma variedade de processos biológicos relevantes para a saúde e a doença.

Usando ultracentrifugação diferencial, a equipa de investigação isolou com sucesso exossomas de carne de porco cozinhada (tecido adiposo, músculo, fígado). A análise transcriptómica revelou diferenças distintas no conteúdo de miRNA encapsulado dentro dos exossomas provenientes de diferentes tecidos. A alimentação de exossomas a ratos e a realização de experiências com laços intestinais confirmaram que os CM-Exo podem ser absorvidos pelo trato intestinal, afetando o peso corporal e os níveis de miRNA no sangue, levando a sinalização endócrina de glucose e distúrbios no metabolismo lipídico hepático. No geral, os microRNAs dentro dos CM-Exo provavelmente servem como fatores reguladores chave na indução de disrupções metabólicas em ratos.

Referência:

1. Shen L, Ma J, Yang Y, et al.Nanovesículas de exossomas derivados de carne de porco cozinhada mediariam desordens metabólicas - o microRNA pode ser o culpado. Revista de Nanobiotecnologia, 2023, 21(1): 83.