Diretrizes para Submissão de Amostras
O que é a Amplificação de Probes Dependente de Ligação Multiplex (MLPA)?
A Amplificação de Probes Dependente de Ligação Múltipla (MLPA) é uma técnica de biologia molecular amplamente utilizada para detectar o número de cópias de várias sequências de DNA na investigação de doenças genéticas humanas. Esta técnica envolve a ligação de oligonucleotídeos de probe seguida de amplificação por PCR, permitindo a análise de até 50 pares de probes multiplex projetados para hibridizar com loci-alvo específicos.
Cada par de sondas é projetado para gerar produtos de amplificação de um comprimento específico. Ao incorporar sequências universais nas suas extremidades, todas as sondas ligadas podem ser amplificadas numa única reação de PCR utilizando um par de primers. O primer de PCR em sentido direto é rotulado com uma etiqueta fluorescente 6-FAM™ da Applied Biosystems™, permitindo a deteção e quantificação com base nos tamanhos moleculares das sondas, conforme determinado através de eletroforese capilar automatizada (CE).
Amplificação por Probes Dependente de Ligações Múltiplas (MLPA) visualizada em três etapas: 1) Desnaturação e Hibridação, 2) Ligação, 3) Amplificação com primers de PCR fluorescentes para detetar variações no número de cópias.
Este método tem sido utilizado com sucesso no estudo de doenças causadas por deleções e duplicações de exões, como a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) e mutações nos genes BRCA1/BRCA2. Além disso, os avanços na técnica MLPA agora permitem a sua aplicação na análise quantitativa da metilação de várias sequências genómicas.
Por que escolher MLPA?
A MLPA é preferida pela sua análise precisa e de alto rendimento, mesmo com amostras de DNA limitadas. Ao contrário da PCR tradicional, a MLPA pode testar múltiplos loci genéticos de uma só vez, tornando-se uma solução económica e fiável para a deteção de anomalias genéticas. É também mais sensível do que outros métodos de PCR multiplex, oferecendo uma melhor deteção de variações no número de cópias (CNVs).
A MLPA combina a hibridização de sondas de DNA com a tecnologia PCR, oferecendo as seguintes vantagens:
- Alta EficiênciaUma única reação pode detectar variações no número de cópias em até 50 sequências-alvo.
- Resposta RápidaExperimentos completos podem ser realizados em 24 horas.
- Simplicidade OperacionalDiferentes kits de reagentes seguem procedimentos quase idênticos, tornando a técnica fácil de aprender e dominar.
Comparação Técnica: MLPA e Métodos Alternativos de Análise Genética
| Parâmetro | MLPA | qPCR | ddPCR | Sequenciação de Sanger | NGS direcionado | WES | WGS | Microarranjo CGH |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Nível de Multiplexação | Até 50 alvos | Poucos | Poucos | N/A | Dezenas–Centenas | Milhares | Genoma completo | Genoma inteiro |
| Principal Propósito | Deteção de CNV | Quantificação | Quantificação | Validação de variantes de sequência | Deteção de variantes (painel) | Variantes de exão | Todas as variantes e SV | genoma CNV em todo o genoma |
| Sensibilidade para CNV | Alto | Moderado | Muito alto | Baixo | Alto | Médio | Alto | Alto |
| Deteção de mutações pontuais | Não | Raro | Limitado | Sim | Sim | Sim | Sim | Não |
| Equipamento Necessário | PCR + CE | máquina de qPCR | instrumento ddPCR | Sequenciador de Sanger | instrumento de NGS | NGS | NGS | Scanner de microarranjos |
| Rendimento | Médio | Baixo | Baixo | Baixo | Médio | Médio | Alto | Alto |
| Precisão Quantitativa | Bom | Variável | Excelente | n/a | Bom | Bom | Bom | Bom |
| Tempo de resposta | ~1 dia | ~1 dia | ~1 dia | cerca de 1 semana | ~1–2 semanas | ~2–4 semanas | ~3–6 semanas | ~2–3 semanas |
| Custo | Baixo | Baixo | Médio | Médio | Médio | Alto | Mais alto | Alto |
Aplicações de MLPA
A MLPA é um método confiável para detetar variações genéticas com alta sensibilidade, e encontra aplicação em vários campos de investigação e clínicos. Permite que os investigadores analisem variações estruturais no genoma, proporcionando informações sobre distúrbios genéticos e mecanismos de doenças. Esta tecnologia versátil suporta uma ampla gama de investigações científicas, incluindo, mas não se limitando a:
- Deteção de Rearranjos Genéticos em Pequena Escala:
Os genes validados incluem BRCA1, BRCA2, MSH2, MLH1, DMD, APC, SMA, NF1, NF2, VHL, TSC1/2, etc.
- Detecção de Rearranjos Genómicos em Grande Escala:
Os distúrbios validados incluem a síndrome de Williams, a síndrome de Prader-Willi/Angelman, a síndrome de DiGeorge, a síndrome do Cri du Chat, a doença de Pelizaeus-Merzbacher, a CMT1A e a HNPP.
- Variações no Número de Cópias Subteloméricas
- Teste de Aneuploidia Cromossómica
- Pesquisa sobre Diagnóstico de Tumores:
Análise do número de cópias de DNA em malignidades como leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), oligodendrogliomas, melanomas e neuroblastomas.
- Análise Quantitativa de Metilação:
As aplicações incluem a síndrome de Prader-Willi/Angelman, a síndrome de Beckwith-Wiedemann, MGMT, MLH1, a síndrome do X frágil e a inativação de genes supressores de tumores.
- Análise da Expressão de mRNA:
Focando em genes envolvidos na apoptose e na resposta inflamatória.
Fluxo de Trabalho do Serviço de Ensaios de Amplificação Dependente de Sonda por Ligação Múltipla
Na CD Genomics, oferecemos um serviço de MLPA simplificado e de ponta a ponta para garantir resultados consistentes e de alta qualidade. O nosso fluxo de trabalho padronizado é projetado para apoiar a reprodutibilidade e acelerar a descoberta em estudos genómicos.
1. Submissão de Amostras
Submeta as suas amostras de ADN, incluindo tecido, sangue ou linhas celulares. A nossa equipa assegura que estas cumpram os padrões de qualidade para análise.
2. Extração de DNA e QC
Se necessário, oferecemos serviços de extração de DNA e realizamos verificações de qualidade para garantir uma qualidade de DNA ideal para MLPA.
Hibridação e Ligação de Probes
As sondas são hibridizadas ao seu DNA e ligadas a regiões-alvo para análise de CNV.
4. Amplificação por PCR
Várias regiões de ADN são amplificadas simultaneamente utilizando primers fluorescentes, permitindo a deteção eficiente de CNV.
5. Eletroforese Capilar
Os produtos amplificados são analisados por eletroforese capilar para uma quantificação precisa de CNV.
6. Análise de Dados e Relatórios
Fornecemos relatórios estatísticos e de anotação detalhados, juntamente com resultados gráficos para uma fácil interpretação.
Requisitos de Amostra para MLPA
| Parâmetro | Requisitos |
|---|---|
| Tecido | Tecido Fresco Congelado ≥ 100mg, FFPE ≥ 4 lâminas, 5~20um |
| Amostra de sangue | ≥ 2~4mL de sangue no tubo de EDTA |
| Linha celular | ≥ 1 x 10^6 células |
| DNA | ≥ 500ng, OD260/280 o mais próximo possível de 1.8~2.0 |
Dicas:
- Envie amostras em gelo azul ou gelo seco para preservar a integridade.
- Serviços de extração de DNA disponíveis mediante solicitação.
- Para tipos de amostras especiais ou cenários de baixo input, entre em contacto connosco para um plano personalizado.
Por que escolher a CD Genomics para o serviço de MLPA?
A CD Genomics oferece um serviço de MLPA abrangente com suporte especializado, resultados rápidos e dados fiáveis. A nossa equipa garante testes de alta qualidade utilizando a mais recente tecnologia, com tempos de resposta rápidos e suporte global. Seguimos um rigoroso controlo de qualidade para fornecer resultados precisos e fiáveis para as suas necessidades de investigação.
- Equipa de Especialistas: A nossa equipa de geneticistas e biólogos moleculares garante resultados de alta qualidade em cada teste.
- Tecnologia de Ponta: Utilizamos as mais recentes plataformas MLPA para garantir dados precisos e fiáveis.
- Rápida Resposta: Receba o seu relatório MLPA completo de forma atempada, garantindo que a sua pesquisa ou tomada de decisão clínica não seja atrasada.
- Alcance Global: A servir clientes em todo o mundo com apoio ao cliente em múltiplos fusos horários.
- Garantia de Qualidade: Seguimos protocolos rigorosos de controlo de qualidade, garantindo que os nossos testes atendem aos mais altos padrões de precisão e fiabilidade.
Referências:
- de Boer, S., White, S.J. Genotipagem de variação do número de cópias multialélica com amplificação por sondas dependentes de ligadura multiplex (MLPA). Em: Genotipagem. Springer, Nova Iorque, NY, 147–153 (2017). https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6442-0_9
- Cuevas, D., Velasco, A. et al. Heterogeneidade intratumoral no carcinoma seroso endometrial avaliada por sequenciação direcionada e amplificação de sondas dependente de ligadura em multiplex (MLPA): um estudo descritivo. Histopatologia 75, 724–733 (2019). DOI: 10.1111/his.14001
- Fu, X., Shi, Y., Ma, J. et al. Avanços da tecnologia de amplificação de sondas dependentes de ligação múltipla na diagnóstico molecular. BioTécnicas 73, 205–213 (2022). DOI: 10.2144/btn-2022-0017
Resultados da Demonstração
Perguntas Frequentes
1. Que tipos de amostras podem ser utilizadas para MLPA?
Pode utilizar ADN genómico extraído de várias fontes, como sangue, saliva ou amostras de tecido.
2. O MLPA pode detectar mutações pontuais?
A MLPA é utilizada principalmente para detectar variações no número de cópias (deletações, duplicações), mas pode ser adaptada para a deteção de mutações em casos específicos.
3. Qual é o custo do teste MLPA?
O custo dos testes MLPA varia dependendo do número de alvos analisados. Por favor, contacte-nos para um orçamento.
Estudo de Caso: Uso Combinado de MLPA e Sequenciação do Exoma Completo (WES) numa Doença Neuromuscular Rara
Referência
Xia Y., Feng Y., Xu L., Chen X., Gao F., Mao S. (2021). Relato de Caso: Sequenciação do Exoma Completo com MLPA Revelou Variações em Dois Genes em um Paciente com Manifestações Combinadas de Atrofia Muscular Espinhal e Distrofia Muscular de Duchenne. Frontiers in Genetics, Volume 12, Artigo 605611. DOI:10.3389/fgene.2021.605611.
1. Contexto
Este caso envolve um paciente do sexo masculino de 11 meses que apresenta um desenvolvimento motor deficiente e fraqueza muscular progressiva. As características clínicas assemelhavam-se a ambas as Atrofia Muscular Espinhal (AME) e Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), que são distúrbios genéticos neuromusculares distintos. Um diagnóstico genético preciso foi crucial, dado os sintomas sobrepostos e as implicações para o tratamento.
2. Métodos
Para identificar a(s) causa(s) genética(s), os clínicos utilizaram um abordagem de teste genético em duas fases:
- Sequenciação do Exoma Completo (WES) para rastrear variantes de sequência em todas as regiões codificantes.
- Amplificação de Probes Dependente de Ligação Múltipla (MLPA) para detectar especificamente variações no número de cópias (VNCs) como deleções em genes-alvo.
A MLPA é um método bem estabelecido para a deteção de CNVs a nível de exão, tornando-o adequado para os loci de DMD e SMA.
3. Resultados
A análise combinada identificou:
- A deleção homozigótica dos exões 7 e 8 no SMN1 gene, consistente com a SMA.
- A deleção no exon 50 do DMD genediagnóstico de DMD.
Esses resultados foram confirmados por MLPA após as previsões do WES.
Relatórios de testes genéticos MLPA mostrando zero cópias dos exões 7 e 8 do SMN1 e uma deleção homozigótica do exão 50 do DMD na amostra do paciente, em comparação com os controlos de referência.
4. Conclusões
A integração de A MLPA e o WES melhoraram a precisão diagnóstica. neste caso complexo envolvendo distúrbios neuromusculares duais. Esta abordagem destaca o valor de combinar a deteção ampla de variantes (WES) com o perfilamento direcionado de CNV (MLPA) para um diagnóstico genético abrangente em fenótipos clinicamente sobrepostos.
