Diretrizes para Submissão de Amostras
Desenvolvimento de Assay de Metilação de DNA
A metilação do DNA desempenha um papel crucial na regulação da expressão génica, com as suas alterações de estado intrinsecamente interligadas ao envelhecimento, desenvolvimento e processos patológicos associados a doenças. Para avaliar a metilação do DNA, existe uma necessidade premente de uma abordagem que ofereça deteção metamórfica de alta capacidade, com resolução de base única, aplicável a várias espécies e tipos de amostras, incluindo amostras fixadas em formalina e incorporadas em parafina (FFPE) e DNA livre circulante (cfDNA) no sangue. Neste sentido, os microarrays de metilação, sendo ferramentas de triagem preliminar convenientes e rentáveis, oferecem vantagens significativas.
Ao longo da última década, a Illumina Inc. tem utilizado a sua tecnologia BeadArray™ para fornecer aos investigadores poderosas ferramentas de microarray destinadas a realizar análises quantitativas da metilação de DNA em todo o genoma. Neste aspecto, os BeadChips Infinium Human Methylation 450 (450K) e Methylation EPIC v1.0 (850k) têm sido amplamente utilizados para facilitar a recolha de dados em Estudos de Associação de Epigenoma (EWAS). Estes microarrays de metilação têm impulsionado a descoberta e aplicação de biomarcadores baseados em metilação na investigação do cancro, doenças genéticas, envelhecimento, epidemiologia molecular e vários outros campos de investigação.
Neste contexto, a Illumina introduziu uma versão atualizada do chip de metilação – o Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip (935k). Mantendo a base química fiável do Infinium original, enquanto atualiza e otimiza numerosos locais de metilação, este novo chip esforça-se por estimular mais descobertas biológicas na nova era da investigação epigenética.
A transição dos arrays de metilação de 450k para 850k, e agora para os atuais 935k, tem visto um aumento contínuo nos locais de metilação detectáveis. Então, que desenvolvimentos novos são evidentes nos 935k em comparação com os seus predecessores?
A matriz EPIC v2.0-935k pode detetar o estado de metilação de aproximadamente 935.000 locais CpG em todo o genoma humano. Baseia-se na EPIC v1.0-850k, eliminando sondas de desempenho inferior, adicionando 186.000 alvos CpG a potenciadores e super-potenciadores, e incluindo mais locais de ligação CTFC, regiões de deteção de CNV, ilhas CpG com cobertura insuficiente na EPIC v1.0 e mutações comuns que impulsionam o câncer. Além disso, a matriz atualizada está alinhada com a versão do genoma HG38 e utiliza a versão v41 da base de dados GenCode, tornando-a mais adequada para pesquisas de EWAS.
Serviço de Análise de Metilação de DNA Humano 935K na CD Genomics
A CD Genomics testou experimentalmente o novo produto utilizando amostras FFPE de baixa qualidade e facilmente degradáveis. Ao investigar a taxa de deteção e os dados de controlo de qualidade de várias fases experimentais, podemos confirmar a aplicabilidade deste novo produto e a fiabilidade das capacidades de deteção da CD Genomics.
Vantagens do Serviço de Análise de Metilação de DNA 935K
Análise do Genoma Completo
Após uma avaliação abrangente do EPIC v1.0 por analistas especializados, foram feitas consideráveis melhorias nas funcionalidades iniciais da sonda. Após a eliminação de sondas de menor desempenho, foram incorporados procedimentos de pesquisa de ponta, aumentando consideravelmente as capacidades do EPIC na área da pesquisa epigenética. O EPIC v2.0 introduz 186.000 novos potenciadores e super potenciadores de CpG, e amplia os locais de ligação do CTCF, zonas de deteção de CNV e complementa os dados sub-representados das ilhas de CpG encontrados no EPIC v1.0. Além disso, a versão 2.0 integra informações sobre mutações motoras relacionadas a cânceres comuns.
Simultaneamente, o Beadchip v2.0 atualizado é capaz de analisar áreas abertas de cromatina identificadas através de experimentos de ATAC-Seq e ChIP-seq, proporcionando aos investigadores científicos um suporte de dados mais abundante e preciso. As características incluem:
- Diferentes posições de metilação descobertas em amostras tumorais e normais de vários tipos de câncer.
- Enhancers e super enhancers identificados em amostras de câncer e linhas celulares através de ChIP-Seq.
- Diferentes regiões de cromatina acessível reconhecidas em cancros humanos primários utilizando ATAC-Seq.
- Expansão da cobertura das ilhas CpG.
- Aumento da cobertura de exões para permitir uma deteção mais precisa de CNVs.
- Mutações em genes condutores associados a cancros comuns.
Tecnologia confiável
O Illumina Methylation BeadChip alcançou resultados de pesquisa inovadores no campo da epigenética na última década. Neste momento, a maioria dos estudos de associação em todo o epigenoma (EWAS) publicados depende do MethylationEPIC ou do seu predecessor, o HumanMethylation450. Consequentemente, os investigadores podem tirar pleno partido dos abundantes dados de chip de metilação em bases de dados públicas como o GEO e o TCGA, acelerando ainda mais o progresso da pesquisa.
Compatível com múltiplos tipos de amostras, incluindo FFPE.
Após um design e validação meticulosos, o ensaio de metilação Infinium demonstra uma fiabilidade superior, como evidenciado pelos dados de alta qualidade obtidos a partir de amostras de tecido FFPE. Dada a importância crucial das amostras FFPE na investigação do câncer, a sua compatibilidade é fundamental para o avanço da pesquisa baseada em grandes bibliotecas de biossample de tumores. Notavelmente, o ensaio Infinium não é apenas aplicável a amostras FFPE, mas também acomoda uma variedade de tipos de amostras, incluindo tecidos frescos/congelados, sangue total, células orais, cfDNA e saliva, garantindo a sua aplicação generalizada em diversos cenários de pesquisa.
Análise de Dados
Requisito de Amostra
| Tipo de Amostra | Requisitos de Amostra |
|---|---|
| DNA Genómico Humano e Animal | Fornecer ≥2ug; remover resíduos de RNA e proteínas; concentração ≥20ng/ul, com base na quantificação Qubit. |
| Tecido Congelado Fresco | Forneça não menos de 10-30mg de tecido; armazene a -20°C ou no congelador a -80°C. |
| Células Cultivadas | Forneça não menos de 2x10^6 células; colete células aderentes ou em suspensão, lave uma vez com PBS, centrifugue a 600g durante 5 minutos, remova o sobrenadante de PBS após a centrifugação, retenha o pellet celular. |
| Amostra de Sangue Total | Forneça 0,5-2ml de sangue periférico ou camada leucocitária; coloque em tubo de centrifugação de 1,5/2,0ml; evite tubos que contenham anticoagulantes que possam interferir na análise. |
| FFPE embebido em parafina | Fornecer ≥1ug; fragmento da banda principal maior que 500bp; concentração ≥20ng/ul; com base na quantificação Qubit. |
| Fornecer não menos de 15 lâminas, área de tecido não inferior a 1cm², espessura de 4-10μM; proporção de células tumorais não inferior a 30%; colocar as lâminas em tubo de centrífuga de 1,5/2,0 ml. | |
| Plasma/Soro/cfDNA | Fornecer >15ng cfDNA, sem genoma de grandes fragmentos, proporção de cfDNA de mononucleossomas não inferior a 50% |
| Fornecer 1-4 ml de plasma/soro |
A perfuração de metilação identifica duas subclasses de carcinoma espinocelular relacionadas a distintas células de origem.
Revista: COMUNICAÇÕES DA NATUREZA (IF=16)
Tecnologia: Illumina Chip de metilação de DNA e RNA-seq.
Contexto da Pesquisa: O carcinoma espinocelular (cSCC) é um tumor maligno que ocorre nas células epidérmicas ou anexiais. É um tipo prevalente de câncer de pele, geralmente causado pela progressão de lesões precoces induzidas pela radiação ultravioleta, conhecidas como ceratose actínica (AK). A maioria das alterações epigenéticas associadas ao cSCC é composta principalmente por um número moderado de genes relacionados ao câncer, silenciados pela alta metilação do promotor da ilha CpG. No entanto, existe apenas uma compreensão parcial da etiologia da AK e do seu crucial processo de transição para cSCC.
Resultados da Pesquisa: Este estudo explora as alterações na metilação do DNA durante a progressão de células epidérmicas saudáveis para AK e, finalmente, para SCC cutâneo. Fornece a análise epigenómica mais abrangente do desenvolvimento do cSCC até à data. Os resultados destacam a existência de duas subclasses distintas de cSCC, refletindo os estágios de diferenciação de diversas origens celulares.
Referência:
- Rodríguez-Paredes, M., Bormann, F., Raddatz, G. et al. A perfuração de metilação identifica duas subclasses de carcinoma espinocelular relacionadas a distintas células de origem. Nat Comum nove, 577 (2018). Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e eu ficarei feliz em ajudar com a tradução.
Q1: Quais sites do chip 850K estão preservados no design do chip 935K?
A2: Na atualização para o chip de metilação, a seguinte informação sobre os locais foi mantida: 1) Ilhas CpG 2) Locais de metilação não CpG em células estaminais humanas (locais CHH) 3) Cromatina aberta e potenciadores ENCODE 4) Potenciadores FANTOM5 5) Locais hipersensíveis à desoxirribonucleotídeo transferase 6) Regiões promotoras de miRNA 7) Abrange mais de 85% dos locais no Infinium Methylation 450 BeadChip.
Q2: Que loci adicionais o chip 935K incorpora com base no chip 850K?
A2: Os seguintes locais foram principalmente adicionados: 1) Locais de metilação diferencial identificados em amostras tumorais e amostras normais em múltiplos tipos de câncer. 2) Melhoradores e super-melhoradores identificados em amostras de câncer e linhas celulares através de ChIP-Seq. 3) Regiões de cromatina diferencialmente acessíveis identificadas em cânceres humanos primários com ATAC-Seq. 4) Cobertura expandida de ilhas CpG. 5) Cobertura exómica melhorada que permite a deteção precisa de CNVs. 6) Mutações comuns que impulsionam o câncer.
Q3. Os dados do chip 935K podem ser analisados em conjunto com os dados do chip 850K?
A3: Sim, os locais sobrepostos do chip 850K e do chip 935K, conforme listado na pergunta 1, podem ser analisados em conjunto.
Q4. O tipo de amostras que o chip 935K pode processar difere das que o chip 850K pode manusear?
A4: Não, os tipos de amostras que podem ser processadas pelo chip 850K podem igualmente ser processadas pelo chip 935K.
Q5. Qual é o requisito para o número de amostras em um único experimento?
A5: A ZKPR é atualmente uma das maiores plataformas de chip de metilação do país e não impõe restrições especiais ao número de amostras.
Q6. Quais são os campos de aplicação dos chips de metilação?
A6: Os chips de metilação são utilizados principalmente no domínio biomédico, como: várias pesquisas sobre câncer (câncer do pulmão, câncer do esôfago, câncer do ovário, etc.); pesquisa de doenças complexas (diabetes, hipertensão, doenças autoimunes, doenças raras, doenças psiquiátricas, etc.); pesquisa do desenvolvimento (desenvolvimento embrionário, diferenciação neural, diferenciação de órgãos, etc.); interações ambientais (tabagismo, consumo de álcool, exposição industrial, poluição, etc.); envelhecimento (idade de metilação); triagem de tumores de cfDNA (várias triagens de biomarcadores), e mais.
