Genotipagem

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Soluções de Genotipagem

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A CD Genomics oferece um serviço de genotipagem totalmente flexível para projetos pequenos, grandes, padrão ou personalizados, em humanos e em muitas outras espécies. O nosso poderoso portfólio inclui arrays, reagentes, instrumentos e ferramentas de bioinformática que permitem detectar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) comuns e raros, variações no número de cópias (CNVs) e outras variações genéticas. Os serviços de genotipagem da CD Genomics acomodam projetos com uma ampla gama de aplicações. Com mais de 10 anos de experiência em serviços, oferecemos um serviço altamente confiável, flexível e competente, combinado com altos padrões da indústria e capacidade escalável, e fomos reconhecidos como a escolha premium de Genotipagem de SNPs.

O que é Genotipagem

A genotipagem serve como um processo científico pelo qual os alelos particulares localizados em determinados sítios genéticos dentro do genoma de um organismo são identificados e descritos. No âmbito da investigação biológica, o propósito fundamental da genotipagem é determinar os tipos de alelos únicos que um organismo possui em loci genéticos designados. Esta prática ajuda a desvendar a correlação entre genótipo e fenótipo, e a influência das variações genéticas nas características e na expressão fenotípica de um organismo. A genotipagem revela disparidades genéticas ao comparar uma sequência de ADN com outra amostra ou uma sequência de referência. Esta técnica facilita a deteção de alterações subtis nas sequências genéticas de uma população, como os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs).

Os Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs) são variantes nucleotídicas bi-alélicas (geralmente) que foram encontradas ao longo do genoma com uma frequência de cerca de um em 1.000 pb. Podem ser encontrados em regiões codificantes, não codificantes e intrónicas dos genomas, e podem afetar a ligação de fatores de transcrição, o splicing de genes, a dobragem de proteínas e muitos outros elementos a nível do gene e do transcrito. Assim, podem ser responsáveis pela diversidade entre indivíduos e pela evolução do genoma, sendo marcadores ideais para identificar genes associados a doenças complexas. Os SNPs são uma das duas fontes mais comuns de variação genética (a segunda são as variantes de número de cópias, CNVs). A análise de SNPs é importante e bastante significativa para estudos como genética relacionada a doenças, gestão de saúde individualizada, melhoramento, etc.

Com base nos objetivos do estudo, a genotipagem de SNP pode ser dividida em dois domínios, genotipagem de genoma completo e mapeamento fino. Genotipagem de genoma completo é uma plataforma para triagem de SNPs. Mapeamento fino aqui é definido como análise de genotipagem de SNP a alta densidade para regiões genómicas seletivas. O mapeamento fino geralmente segue estudos em larga escala em todo o genoma para focar em potenciais genes associados à doença de interesse e requer a validação de menos SNPs (por exemplo, menos de 1.000) altamente específicos para cada doença para um tamanho de amostra maior, devendo alcançar uma alta taxa de chamada para todos os SNPs selecionados, sem processos de otimização de ensaios que consomem muito tempo, e a um nível de multiplexagem relativamente alto.

Uma questão chave na genotipagem de alto rendimento é escolher a tecnologia apropriada para os seus objetivos e para a fase do seu experimento. A CD Genomics oferece aos investigadores a flexibilidade de perfilar amostras com milhares a milhões de marcadores em formato de alto rendimento, e fornecer uma cobertura densa do genoma com o conteúdo mais atualizado disponível da comunidade científica.

Figura 1. Tipos de variantes genéticas. (Kockum et al., 2023)

Quais são os Métodos de Genotipagem?

A genotipagem é um procedimento complexo que emprega diversas técnicas para dissecção e caracterização de distintos loci genéticos dentro do genoma de um indivíduo. Aqui está um resumo exaustivo das metodologias constituintes que tornam este processo possível:

• Preparação de DNA:

A extração de DNA genómico envolve a isolação de DNA cromossómico a partir dos núcleos das células através da utilização de detergentes e cisalhamento mecânico. Segue-se a remoção de proteínas e detritos celulares para obter DNA purificado. Os métodos de extração podem ser de natureza orgânica ou podem utilizar kits comerciais que aproveitam colunas de filtração ou esferas magnéticas, processando amostras biológicas como sangue, saliva ou materiais de biópsia incorporados em parafina.

• Hibridação:

Métodos de genotipagem como PCR, microarrayse NGS Aproveitar a hibridização, um processo que envolve o emparelhamento de fragmentos de ADN de cadeia simples complementares para criar moléculas de cadeia dupla, dependendo do emparelhamento de bases entre esses fragmentos, é fundamental.

• Técnicas Baseadas em PCR:

A Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) facilita a amplificação rápida de sequências específicas de DNA, o que ajuda na genotipagem automatizada. Técnicas como PCR específica para alelos e PCR-RFLP são amplamente utilizadas na genotipagem para a detecção de alelos específicos ou para distinguir entre alelos com base nos padrões de digestão por enzimas de restrição. A PCR TaqMan, conhecida pelo uso de sondas específicas para alelos com etiquetas fluorescentes, é prevalente na genotipagem de SNPs candidatos.

• iPLEX:

A metodologia iPLEX é baseada na tecnologia MassARRAY da Sequenom. Utiliza primers específicos de locus e terminadores de didesoxinucleotídeos modificados em massa para genotipagem, que são detetados com espectrometria de massa MALDI-TOF.

• Pirosequenciação:

A pirosequenciação é utilizada para fragmentos curtos de DNA. Envolve a síntese de novas cadeias de DNA um nucleótido de cada vez, com emissão de luz a cada incorporação de nucleótido, facilitando a análise de genotipagem.

• Técnicas de Microarranjos:

Microarrays, como os Affymetrix GeneChip e os arrays de beads da Illumina, são uma parte fundamental do genotipagem em larga escala. Eles baseiam-se na hibridação de fragmentos de DNA a pontos de DNA sintetizados artificialmente que contêm sequências de SNP. A deteção de sinais após esta hibridação ajuda na determinação do genótipo.

• Sequenciação de Nova Geração (NGS):

As plataformas de NGS permitem o sequenciamento massivamente paralelo de fragmentos de DNA e possibilitam a genotipagem de alto rendimento. Este processo incorpora uma multitude de etapas, incluindo preparação de amostras, geração de clusters, sequenciamento por síntese e análise de dados. Permite a identificação e deteção de novos polimorfismos e mutações. Dentro da genotipagem, as diferenças nas sequências de DNA entre amostras no mesmo locus são identificadas. Além disso, no caso de a amostra ser RNA, o NGS pode quantificar a expressão gênica. A vantagem distinta desta metodologia para genotipagem é a sua capacidade de identificar novos polimorfismos/mutações, uma capacidade que se destaca em relação a outros métodos de genotipagem, como microarranjos.

Figura 2. Métodos de genotipagem selecionados. (Kockum et al., 2023)

Os nossos serviços de Genotipagem

Oferecemos diferentes tecnologias de genotipagem dependendo da aplicação e da espécie, o objetivo da análise, o número de SNPs por amostra (desde apenas alguns até cinco milhões) e o número de amostras no estudo. Os nossos serviços abrangentes de genotipagem de SNP incluem tanto ensaios de genotipagem em todo o genoma para rastreio de SNPs como ensaios de mapeamento fino para validação de SNPs com base em 5 plataformas—Affymetrix, Illumina, Sequenom MassARRAY, ABI TaqMan e ABI 3730XL:

• Genotipagem de SNPs em Genoma Completo

  • Genotipagem por Sequenciação (GBS). Empregamos as mais recentes plataformas de sequenciação Illumina para obter informações sobre variações genéticas de uma forma mais eficiente. O GBS, um subconjunto das técnicas de Sequenciação do Genoma de Representação Reduzida, é utilizado para identificar SNPs em investigações de genotipagem. O GBS simplifica a complexidade do genoma ao utilizar enzimas de restrição para clivar o DNA, juntamente com adaptadores com códigos de barras de DNA. Através da seleção judiciosa de enzimas de restrição, o GBS oferece uma ampla cobertura de SNPs em regiões ricas em genes do genoma de forma económica, aumentando o número de marcadores no ensaio. A presença consistente de locais de restrição entre espécies garante uma alta consistência genómica dentro das populações, tornando o GBS particularmente adequado para inquéritos.

    Microarray de SNPConvergência da hibridização de DNA, microscopia de fluorescência e captura de DNA em superfícies sólidas através de Arrays da Affymetrix e Illumina. A CD Genomics oferece uma ampla gama de serviços de genotipagem utilizando detecção avançada de variantes e Genotipagem de SNPs tecnologias. Os microarrays desempenham um papel crucial na exploração de variações genéticas, como SNPs e alterações estruturais, apoiando aplicações desde a descoberta inicial até a triagem rotineira. Os microarrays de genotipagem da Affymetrix e da Illumina são altamente respeitados pela sua performance consistente em várias áreas, incluindo medicina de precisão, pesquisa clínica, farmacologia, triagens de consumidores e agricultura. Estes microarrays são personalizáveis para espécies específicas e preferências de SNP, oferecendo múltiplas estratégias de genotipagem para atender a diversas necessidades de pesquisa.

    2b-RAD. Um novo método de genotipagem genómica de baixo custo, 2b-RAD, utiliza enzimas de restrição tipo IIB para gerar fragmentos de ADN de tamanho fixo, visando todos os locais de restrição para uma profundidade de sequenciação uniforme e alta reprodutibilidade. Este método, combinado com a sequenciação de extremidades pareadas da Illumina, oferece vantagens como baixo custo de sequenciação, resistência à degradação do ADN e flexibilidade no design da biblioteca em comparação com o RAD tradicional e GBS técnicas.

    ddRAD-seqddRAD-seq, uma ferramenta preferida entre ecologistas moleculares, utiliza sequenciação de próxima geração (NGS) plataformas para criar novos marcadores SNP. Ao explorar a especificidade das enzimas de restrição endonuclease, gera fragmentos de biblioteca que representam regiões genómicas únicas partilhadas entre indivíduos da mesma espécie. Isso permite o sequenciamento eficiente e a comparação dessas regiões genómicas entre indivíduos, facilitando o desenvolvimento rápido e eficaz de numerosos marcadores genéticos.

    Genotipagem de SNP por PCR-LDRTecnologias de marcadores moleculares de alto rendimento, como chips SNP e Genotipagem por Sequenciamento (GBS) têm amplas aplicações na investigação genética, incluindo a descoberta de SNPs, melhoramento de culturas e estudos de associação genómica. No entanto, o seu custo e complexidade limitam a sua utilização no melhoramento de culturas. Em vez disso, são frequentemente utilizados marcadores moleculares baseados em PCR que visam loci polimórficos funcionais. Estes marcadores utilizam a ligase de DNA Taq para detectar variações nos genótipos, permitindo uma deteção precisa dos locais de SNP.

    RAD-seq. RAD-seq, uma inovadora sequenciação de nova geração (NGS) a técnica é projetada para direcionar locais específicos de clivagem genómica usando endonucleases de restrição, resultando na geração de fragmentos de DNA predefinidos adequados para sequenciação de alto rendimento. A sua adaptabilidade torna-a bem adequada para investigações abrangentes, proporcionando contribuições valiosas nos campos da identificação de SNPs, mapeamento genético, genómica funcional, genética de populações e além, oferecendo assim implicações significativas tanto para esforços de pesquisa quanto para aplicações industriais.

• Mapeamento Fino de SNPs

  • Genotipagem de SNPs MassARRAYUma plataforma de deteção não fluorescente que utiliza espectrometria de massas para medir de forma precisa e sensível amplicões derivados de PCR.

    SNaPshot. Um método baseado na extensão de primers para genotipagem de posições SNP conhecidas através do analisador de DNA automatizado.

    Genotipagem de SNP TaqManUm método de genotipagem de SNP comumente utilizado, desenvolvido pela Life Technologies.

    

• Genotipagem de CNV

  • Microarranjo CGHA CGH de microarray permite um rastreio abrangente do genoma a alta resolução, facilitando a deteção de desequilíbrios de número de cópias anteriormente indetectados, como deleções e duplicações. A CD Genomics oferece serviços de microarray CGH para várias espécies, incluindo humano, rato, ratazana e galinha, com a opção de arrays CGH personalizados adaptados a outras espécies.

• Serviço de Fragmentos de DNA

  • Genotipagem de MicrossatélitesA CD Genomics especializa-se na seleção e design de marcadores de microsatélites em diversas espécies. Além da genotipagem de microsatélites, oferecemos uma genotipagem eficiente por sequenciação (GBS) para otimizar tempo e recursos. Aproveitando a PCR e sequenciação de próxima geraçãoA genotipagem assegura uma diferenciação de alelos precisa e económica.

    Análise de Instabilidade de MicrosatélitesA instabilidade de microsatélites (MSI) resulta de erros na replicação do DNA, onde bases repetidas (microssatélites) são inseridas ou deletadas devido à falha do sistema de reparo de desajustes (MMR). A CD Genomics utiliza o kit da Promega, empregando PCR multiplex fluorescente com eletroforese capilar, para detectar o estado de MSI.

    Desenvolvimento de Microssatélites. A CD Genomics agora oferece um sequenciação de próxima geraçãométodo baseado para desenvolver marcadores de microsatélites adaptados à sua espécie de interesse, contribuindo para o avanço científico. Os microsatélites, ou SSRs, são sequências de DNA repetitivas prevalentes em genomas eucarióticos, caracterizadas por um alto polimorfismo e adequação para vários estudos genéticos. NGS revoluciona o desenvolvimento de marcadores de microsatélites, oferecendo uma análise de alto rendimento e custo-efetiva, mesmo para organismos não-modelo. Utilizando a tecnologia Illumina, milhões de leituras de fragmentos curtos são geradas e analisadas bioinformaticamente para identificar loci polimórficos.

    Oi-SSRseqOs microssatélites, ou SSRs, são marcadores genéticos essenciais na genética de populações. No entanto, os métodos tradicionais de genotipagem baseados apenas no comprimento dos fragmentos podem ignorar SNPs e indels, levando a resultados imprecisos. A CD Genomics oferece o Hi-SSRseq, que combina a amplificação de SSR com sequenciação de alto rendimento para uma genotipagem precisa. Este método fornece dados de sequência nucleotídica para SSR e regiões adjacentes, permitindo uma avaliação precisa da variabilidade genética e reduzindo o tempo e o custo da genotipagem.

Requisitos de amostra

Pipeline de Análise

Os dados de entrada fundamentais podem incluir diversos tipos de dados de microarrays e sequenciação de próxima geração. dados como sequenciação do genoma completo ou sequenciação do exoma completo dados. Normalmente, os resultados de genotipagem a partir de dados de microarray são fornecidos pelo fabricante do chip. O pipeline subsequente delineia a abordagem sistemática para analisar a genotipagem utilizando dados de sequenciação do genoma completo.

Vantagens dos Nossos Serviços de Genotipagem

• A adesão rigorosa a padrões rigorosos garante a entrega de soluções de genotipagem abrangentes.
• Especialização em várias facetas de genotipagem, incluindo design de ensaios, processamento de amostras e análise de dados, garantindo resultados precisos e perspicazes.
• Um tempo de resposta rápido, aliado a uma precisão e fiabilidade inabaláveis, torna os nossos serviços de genotipagem eficientes e confiáveis.
• A versatilidade para lidar com diversos tipos de amostras, abrangendo genomas humanos, animais, vegetais e microbianos, sublinha a nossa capacidade de atender a uma ampla gama de necessidades de investigação.
• Compromisso com o avanço da investigação em genómica, oferecendo acesso a tecnologias e metodologias de genotipagem de ponta.
• Serviços personalizados adaptados para atender aos requisitos únicos de cada projeto, garantindo uma abordagem personalizada e eficaz à análise de genotipagem.
• Abordagem consultiva para identificar soluções ótimas e rentáveis, capacitando os investigadores a alcançar os seus objetivos de pesquisa específicos com máxima eficiência.

O nosso pacote de serviços inclui:

• Plataforma escalável. A CD Genomics é capaz de realizar uma análise eficaz em amostras pequenas a grandes devido à sua variedade de plataformas de genotipagem de SNP.
• Garantia de qualidade. Através do nosso rigoroso processo de controlo de qualidade, fornecemos apenas dados de alta resolução e alta qualidade para a máxima fiabilidade.
• Desenho de experimento. Seleção de SNPs adequados para o propósito da pesquisa e, em seguida, seleção da plataforma com base no número de amostras e nas possibilidades de design.
• Genotipagem. Validação da existência e frequência de SNPs conhecidos e descoberta de SNPs novos.
• Dados. Fornecidos em formato Excel. Para a descoberta de SNPs, dados brutos, anotação e resultados de LD também são fornecidos.

Exibição de Resultados

A aplicação de abordagens de bioinformática à análise de Genotipagem de SNPs e as Variações no Número de Cópias (CNVs) permitem a análise de resultados de milhões de marcadores e sondas, a deteção de amostras atípicas e a previsão das consequências funcionais das variações genéticas. Apresentadas abaixo estão representações gráficas dos resultados gerados utilizando diversas técnicas de genotipagem.

A nossa meta é fornecer o mais alto nível de serviço, confidencialidade e apoio ao cliente. A nossa vasta experiência pode ajudar a acelerar as suas análises de SNP e mutações com rapidez, qualidade e fiabilidade. Com os nossos serviços, pode aprofundar-se no genoma ou procurar conexões desconhecidas entre genótipo e fenótipo ou variações de genótipo já conhecidas.