Desenvolvimento de Microssatélites

A CD Genomics agora oferece um sequenciação de próxima geração método baseado para desenvolver marcadores de microsatélites para a sua espécie de interesse, para beneficiar a comunidade científica.

A Introdução ao Desenvolvimento de Microsatélites

Microssatélites, também referidos como SSR, consistem em um motivo repetido com um a seis nucleotídeos, e são ubíquos na maioria dos genomas eucarióticos. Variações no número de repetições geram diferentes alelos. Os SSR apresentam alta polimorfismo, especificidade genómica, abundância e codominância. Isso torna-os marcadores moleculares apropriados para melhoramento assistido por marcadores moleculares, filogenética molecular e genética populacional.

Sequenciação de próxima geração (NGS) é recentemente utilizado para desenvolver marcadores de microsatélites. Métodos tradicionais que dependem de sequenciação capilar são demorados e complexos. Comparado aos métodos tradicionais, NGS tem as vantagens de alta capacidade de produção, aumentando massivamente a saída e com baixo custo. Pode analisar suficientemente até organismos não-modelo. Utilizámos a tecnologia de NGS da Illumina para produzir milhões de leituras de fragmentos curtos, que foram filtradas com conjuntos de ferramentas de bioinformática para identificar primers que amplificam locos de microssatélites polimórficos.

O fluxo de trabalho geral para o desenvolvimento de microssatélites está descrito abaixo.

• preparação de biblioteca de DNA e sequenciação shotgun com a plataforma Illumina.
• Análise dos resultados de sequenciação com ferramentas de bioinformática e identificação de potenciais loci de microssatélites para o desenvolvimento de primers.
• Síntese de primers e seleção de locos de microssatélites através de testes em vários indivíduos para avaliar a amplificação e o polimorfismo.
• Análise dos indivíduos que gostaria que genotipássemos apenas com aqueles pares de primers selecionados que amplificaram locos polimórficos.

Iremos analisar pelo menos 8 amostras em até 60 loci, tentar a otimização da PCR para todos os loci e, por fim, faremos o nosso melhor para identificar 10 loci polimórficos, mas não podemos garantir, pois algumas populações não apresentam um nível 'normal' de polimorfismo.

Vantagens do Desenvolvimento de Microssatélites

A aplicação de Sequenciação de Alto Débito (HTS) o desenvolvimento de microssatélites eleva consideravelmente a sua eficiência e precisão, oferecendo várias vantagens notáveis em relação aos métodos tradicionais:

• Aquisição massiva de dados: A HTS pode gerar um volume considerável de dados de sequências genómicas em um curto espaço de tempo, reduzindo significativamente o prazo para o desenvolvimento de microssatélites.
• Automação: Desde a sequenciação até à análise de dados, uma série de processos pode ser automatizada, reduzindo a necessidade de intervenção manual.
• Cobertura abrangente: Com o potencial de cobrir a maior parte do genoma, incluindo regiões não codificantes e de baixa complexidade, HTS aumenta a abrangência da identificação de microssatélites.
• Alta resolução: HTS aumenta a precisão na identificação das unidades repetidas e quantidades de microssatélites, reduzindo assim as chances de erro na identificação.
• Custos reduzidos por instância única: Apesar dos custos iniciais mais elevados dos equipamentos, os desenvolvimentos progressivos na tecnologia têm continuamente reduzido os custos de sequenciação por instância, tornando o desenvolvimento em grande escala de microssatélites mais económico.
• Processamento paralelo: O HTS permite o processamento simultâneo de múltiplas amostras, reduzindo ainda mais os custos por unidade de amostra.
• Possibilidade de análise em múltiplas camadas: HTS oferece não apenas informações sobre microssatélites, mas também pode ser utilizada para outras análises genómicas (como deteção de SNP, análise de expressão génica, etc.), fornecendo suporte de dados para uma investigação abrangente.
• Descoberta de Novos Microssatélites: Em comparação com métodos tradicionais, o HTS pode identificar mais novos marcadores de microssatélites, expandindo assim a biblioteca de marcadores de microssatélites.

Aplicação do Desenvolvimento de Microsatélites

Estudando a Diversidade Genética e a Estrutura Populacional: Ao aproveitar sequenciação de alto rendimento Para a identificação e desenvolvimento de numerosos marcadores de microsatélites, é possível realizar análises abrangentes que examinam a estrutura genética das populações, o fluxo gênico e a variação genética. Este processo pode fornecer informações cruciais sobre a dinâmica populacional, bem como sobre os processos evolutivos.

Mapeamento de Sequências Genómicas e Localização de Locais de Características Quantitativas (QTL): Os marcadores de microssatélites desempenham um papel vital na construção de mapas de ligação genética, bem como na localização de Locais de Características Quantitativas (QTL). A precisão e a densidade dos marcadores, aprimoradas pelo sequenciamento de alto rendimento, elevaram o padrão em termos de resolução alcançável no mapeamento genómico.

Identificação de Espécies e Classificação Taxonómica: Marcadores de microsatélites desenvolvidos utilizando tecnologia de alta capacidade podem ser eficazmente utilizados em esforços relacionados com a identificação de espécies e investigação taxonómica. Eles ajudam no reconhecimento de discrepâncias genéticas entre espécies ou populações distintas, sustentando assim os esforços na conservação e gestão da diversidade biológica.

Pesquisa em Biologia Evolutiva: Marcadores de microsatélites, obtidos através de sequenciação de alto rendimento, podem ser instrumentais na realização de estudos evolutivos em várias espécies ou grupos populacionais. Podem revelar a história evolutiva e as relações filogenéticas dos sujeitos de estudo, enriquecendo assim a nossa compreensão dos mecanismos por trás da evolução biológica.

Aplicações Agrícolas e de Reprodução: Dentro dos domínios da agricultura e da reprodução, marcadores de microsatélites desenvolvidos usando sequenciação de alto rendimento pode ser utilizado para confirmação da identidade de raças, seleção em programas de reprodução e implementação de melhorias genéticas em espécies tanto vegetais como animais. Isso aumenta a eficácia e a precisão dos esforços agrícolas e de reprodução.

Fluxo de Trabalho para Desenvolvimento de Microssatélites

A implementação de Sequenciação de Nova Geração (NGS) a tecnologia na cultura de microssatélites aumentou significativamente a sua eficiência, precisão e custo-efetividade. Através de um progresso sistemático que abrange a preparação de amostras, Sequenciação de DNA, processamento de dados, identificação de microssatélites, conceção de primers, validação do primer e teste de polimorfismo, podemos promover de forma rápida e eficaz o desenvolvimento de marcadores de microssatélites.

Especificação de Serviço

	Requisitos de Amostra Amostra de DNA ou tecido isolada As amostras de tecido podem ser preservadas utilizando etanol, gel de sílica, congelamento ou outros métodos adequados. 1 µg de DNA de alto peso molecular Por favor, envie quaisquer dados de QC (seja uma cópia da imagem de Eletroforese em Gel ou medições de Qubit) para a amostra.
	Estratégias de Sequenciamento Plataforma Illumina Até 50 milhões de leituras Até 15 GB
	Análise de Dados Montagem de novo Alinhamento de genoma de referência Identificação de microssatélites Análise de polimorfismo Análise genética populacional Dependendo das especificidades do seu projeto, poderemos precisar de amostras de ADN adicionais que representem a população de interesse para avaliar a polimorfia e a funcionalidade dos candidatos a marcadores.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados

A CD Genomics está dedicada a fornecer-lhe SSRs polimórficos testados e garantidos prontos a usar, e não temos nenhum direito legal sobre quaisquer um dos seus marcadores SSR. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Referência:

1. Feng S, He R, Lu J, et al.Desenvolvimento de marcadores SSR e avaliação da diversidade genética em cultivares medicinais de Chrysanthemum morifolium. Fronteiras em Genética. 2016, 7:113.

Resultados da Demonstração

(Feng et al.., 2016)

Perguntas Frequentes sobre o Desenvolvimento de Microssatélites

1. Por que é que os microsatélites são importantes na investigação genética?

Os microssatélites têm um valor substancial como marcadores genéticos em uma variedade de investigações genéticas, dada a sua alta variabilidade, herança co-dominante e presença prolífica nos genomas. Eles são frequentemente utilizados em estudos de genética populacionalbiologia evolutiva, exames forenses, testes de paternidade, e mapeamento de ligação.

2. Como são desenvolvidos os microsatélites?

A derivação de microssatélites geralmente começa com a sequenciação de alto rendimento do DNA genómico, progredindo para uma análise bioinformática para identificar sequências repetitivas. Subsequentemente, as sequências são analisadas quanto à adequação de locos de microssatélites, com base em fatores determinantes como o comprimento dos motivos repetidos, a quantidade de repetições e as características das regiões flanqueadoras.

3. Quais fatores devem ser considerados durante o design de primers para microssatélites?

O design de primers para microssatélites envolve a consideração cuidadosa de vários parâmetros importantes. Estes incluem o comprimento dos primers, que geralmente varia entre 18 a 25 nucleotídeos, a temperatura de fusão (Tm), o conteúdo de pares de Guanina-Citosina (conteúdo de GC) e a especificidade em relação ao alvo. Juntos, esses fatores ajudam a garantir a amplificação bem-sucedida do locus de microssatélite alvo através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

4. Como são validados os marcadores de microssatélites?

A validação de marcadores de microssatélites pode ser realizada através da amplificação por PCR focada nos loci desejados, com primers gerados que são especificamente desenhados para a tarefa. Este passo é então seguido por análises de eletroforese que examinam e confirmam os tamanhos esperados dos amplicons. Uma análise subsequente para polimorfismo é realizada para verificar as disparidades dos alelos de microssatélites entre vários organismos ou populações.

5. Quais são alguns dos desafios associados ao desenvolvimento e aplicação de microssatélites?

O processo de desenvolvimento de microssatélites pode enfrentar certos desafios, como localizar loci adequados que demonstrem um elevado grau de polimorfismo e mitigar o risco de genotipagem erros que podem resultar de bandas de gagueira ou perda de alelos. Além disso, podem surgir desafios de natureza técnica em relação à transferibilidade entre espécies e ao desenvolvimento de ensaios de PCR multiplex.

Estudos de Caso sobre Desenvolvimento de Microssatélites

Desenvolvimento de Novos Marcadores SSR para LinhoLinho comum L.) Usando Sequenciação Genómica de Representação Reduzida

Revista: Fronts Plant Sci
Fator de impacto: 4,298
Publicado: 13 de janeiro de 2017

Fundo

A criação de linho no nordeste da China enfrenta desafios na desenvolvimento de variedades adaptáveis com rendimento e qualidade melhorados. A seleção assistida por marcadores (SAM) oferece uma solução, com os recentes avanços na descoberta de marcadores SSR a mostrarem-se promissores. Utilizando sequenciação de próxima geração métodos, numerosos marcadores SSR foram rapidamente identificados, auxiliando os programas de melhoramento. A plataforma de sequenciamento Illumina, escolhida pela sua alta capacidade de produção e precisão, facilitou a identificação sistemática de marcadores SSR para uso imediato no melhoramento do linho.

Métodos

Resultados

No genoma do linho, os autores identificaram 1.720 loci de Repetições de Sequência Simples (SSR), dos quais 1.574 são descobertas novas. Os tipos de motivos SSR consistem predominantemente em repetições de trinucleotídeos (56,1%) e dinucleotídeos (35,23%), de acordo com os nossos dados apresentados na Tabela 1.

Tabela 1. Frequências de diferentes tipos de motivos de repetição SSR.

Fig 1. Números de SSRs dinucleotídicos e trinucleotídicos classificados com base nos seus motivos.

Utilizando 62 pares de primers, a identificação de polimorfismos foi realizada em 48 variedades de linho do nordeste da China, revelando a sua classificação principalmente em tipos de fibra e óleo (Fig 2). Notavelmente, dentro do tipo de fibra, as cultivares "NEW1" e "Venus" apresentaram antecedentes genéticos significativamente distintos. Da mesma forma, o antecedentes genético de "A0529" diferiu dos outros tipos de óleo. Consequentemente, estas três cultivares de linho têm implicações significativas para os esforços de melhoramento do linho.

Fig 2. Diversidade genética de 48 cultivares/acessos de linho com base em marcadores SSR.

Conclusão

Os autores desenvolveram 1574 novos SSRs em linho utilizando sequenciação de genoma de representação reduzida. Dentre estes, 62 locais de SSR foram selecionados para o desenho de primers para avaliar a diversidade genética em 48 variedades de linho. Os resultados mostraram uma clara diferenciação entre as variedades de linho para fibra e para semente de linhaça. Estes SSRs serão cruciais para a análise genética e mapeamento em linho e outras culturas.

Referência:

1. Wu J, Zhao Q, Wu G, et al.Desenvolvimento de novos marcadores SSR para linhoLinum usitatissimum L.) utilizando sequenciação genómica de representação reduzida. Fronteiras na ciência das plantas. 2017(7):2018.