Sequenciação de Bisulfito com Representação Reduzida

A CD Genomics está a oferecer um serviço de sequenciação bisulfito de representação reduzida (RRBS) com resolução a nível de nucleótido único, reduzindo a quantidade de sequenciação necessária enquanto captura a maioria dos promotores e outras regiões genómicas relevantes. O RRBS é favorável para a descoberta de biomarcadores através da identificação e análise de regiões diferencialmente metiladas (DMRs) entre amostras.

A Introdução do RRBS

A metilação do DNA da citosina é uma modificação epigenética envolvida na regulação da expressão génica. A metilação do DNA ocorre predominantemente em contextos CpG, e estes dinucleotídeos CpG são mais abundantes em regiões selecionadas do genoma. O RRBS é uma abordagem poderosa para a análise da metilação do DNA em todo o genoma que combina a digestão por enzimas de restrição com sequenciação por bisulfito para enriquecer uma fração densa em CpG do genoma. Esta combinação torna o RRBS mais eficiente na utilização de amostras e a plataforma perfeita para estudos piloto e aplicações clínicas.

O RRBS sequencia apenas os fragmentos referentes a regiões ricas em CpG a um custo significativamente reduzido quando comparado com sequenciação de bisulfito de genoma completo (WGBS)A RRBS é muito rentável, dado que cerca de 1-5% do genoma é sequenciado, cobrindo cerca de 12% dos locais de CpG em todo o genoma e cerca de 84% das ilhas de CpG nos promotores. As plantas exibem uma distribuição de CpG diferente: (i) carecem de ilhas de CpG características nos promotores; (ii) ocorrem em bases de citosina dentro de todos os contextos de sequência. Portanto, enquanto a enzima MspI é comumente utilizada em animais e humanos, a enzima SacI/MseI é frequentemente utilizada em plantas.

Vantagens do RRBS

• Baixo requisito de DNA de entrada
• Padrão de metilação da região rica em CpG em todo o genoma
• Cobertura de até 5 milhões de locais CpG em Humanos
• Deteção simultânea de metilação de DNA e SNPs.
• Descoberta de biomarcadores epigenéticos
• Resolução de nucleótidos únicos e eficiência de custos

Aplicações de RRBS

A sequenciação de bisulfito com representação reduzida pode ser utilizada para, mas não se limita a, as seguintes investigações:

Investigação do CancroA investigação sobre o câncer utiliza a tecnologia RRBS para mapear meticulosamente os perfis de metilação do DNA em diferentes tipos de câncer. Ao analisar as disparidades nos padrões de metilação entre tecidos cancerígenos e saudáveis, o RRBS ajuda a identificar marcadores de metilação específicos do câncer. Isso lança luz sobre os processos epigenéticos envolvidos no início e desenvolvimento do câncer. Além disso, o RRBS revela alterações específicas na metilação do DNA que podem ser potencialmente utilizadas como indicadores precoces para estratégias de diagnóstico inovadoras. Esta abordagem sublinha o papel fundamental da epigenética na investigação do câncer e enfatiza a busca por novos biomarcadores para deteção e intervenção precoces.

Biologia do DesenvolvimentoA tecnologia RRBS é um ativo valioso para investigar as mudanças multifacetadas na metilação do DNA que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário. Permite uma análise abrangente dos padrões de metilação específicos de estágio e de tipo celular, lançando luz sobre a dinâmica intrincada da regulação epigenética. Além disso, o RRBS possibilita a observação das modificações na metilação do DNA ao longo da diferenciação das células-tronco, desvendando os mecanismos epigenéticos que orquestram de forma intrincada a determinação do destino celular e a expressão gênica.

NeurociênciaNa neurociência, o RRBS investiga perfis de metilação do DNA em distúrbios neurológicos como a doença de Alzheimer e o autismo, revelando a sua base epigenética e melhorando as estratégias de diagnóstico e terapêuticas. Além disso, o RRBS explora alterações na metilação do DNA ligadas à formação de memórias e aos processos de aprendizagem, avançando na compreensão da regulação epigenética na função neural e no comportamento.

Estudos Evolutivos e EcológicosA tecnologia RRBS serve como uma ferramenta poderosa para realizar estudos comparativos sobre padrões de metilação do DNA entre diversas espécies ou populações no âmbito da pesquisa evolutiva e ecológica. Através desta metodologia, os investigadores podem explorar os impactos da epigenética nas dinâmicas evolutivas e nas respostas adaptativas. Além disso, o RRBS investiga as repercussões de fatores ambientais, como a poluição e as variações nutricionais, na complexa modulação da metilação do DNA, revelando assim a intrincada interação entre as alterações epigenéticas e as influências ambientais.

Ciência AgrícolaNo domínio da ciência agrícola, o RRBS serve como uma ferramenta fundamental para analisar perfis de metilação do DNA dentro de sistemas de culturas relevantes para atributos cruciais, incluindo resistência a doenças, capacidade de rendimento e qualidade do produto. Essas análises fornecem orientações críticas para iniciativas de melhoramento destinadas a avançar as qualidades das variedades de culturas. Além disso, na área do melhoramento de gado, o RRBS identifica indicadores epigenéticos associados a características de produção desejadas e ao bem-estar geral, contribuindo assim com informações que informam escolhas estratégicas de melhoramento e elevam a eficácia dos regimes de melhoramento.

Fluxo de Trabalho RRBS

O fluxo de trabalho geral para sequenciação RRBS é descrito abaixo. O RRBS utiliza a enzima de restrição MspI para cortar em locais CCGG ao longo do genoma, enriquecendo regiões ricas em CpG. As regiões que contêm CpGs são então recuperadas por purificação em gel. Após a ligação do adaptador metilado, reparação das extremidades e adição de cauda dA, estes fragmentos são então convertidos por bisulfito, amplificados e sequenciados. A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais.

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra DNA genómico ≥ 1 μg, Quantidade Mínima: 20 ng, Concentração ≥ 20 ng/µl Células ≥ 5×106Quantidade Mínima: 3×103 Tecido ≥ 30 mg OD 260/280=1,8~2,0 Todo o DNA deve ser tratado com RNase e não deve apresentar degradação ou contaminação. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciamento Preparação de biblioteca RRBS Illumina HiSeq X Ten, pareado de 150 bp Profundidade de sequenciamento > 50M leituras limpas Mais de 80% das bases com uma pontuação de qualidade ≥Q30
	Análise de Dados Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Alinhamento contra o genoma de referência Análise da cobertura de promotores e ilhas CpG Análise do nível de metilação de ilhas CpG e promotores análise de regiões diferencialmente metiladas (DMR) Anotação funcional de genes diferencialmente expressos Relação entre o nível de metilação e o comprimento dos elementos funcionais Distribuição da região CpG Distribuição regional de genes Nota: Os dados de saída recomendados e os conteúdos da análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na representação reduzida de sequenciação por bisulfito para a sua escrita (personalização)

Ao combinar a digestão enzimática, a conversão por bisulfito e tecnologia NGSA CD Genomics é capaz de fornecer RRBS como uma alternativa para gerar e perfilar metilomas em todo o genoma a um custo reduzido. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Referências:

1. Guo H, Zhu P, Guo F, et al.Perfilando paisagens do metiloma de DNA de células mamíferas com sequenciação de bisulfito de representação reduzida em célula única. Protocolos da Natureza, 2015, 10(5): 645.
2. Meissner A, Gnirke A, Bell G W, et al.Sequenciação de bisulfito com representação reduzida para análise comparativa de metilação de DNA em alta resolução. Pesquisa em ácidos nucleicos, 2005, 33(18): 5868-5877.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

1. Qual é o fluxo de trabalho para RRSB?

O fluxo de trabalho do RRBS é demonstrado na Figura 1 abaixo. Resumidamente, o DNA é primeiro digerido, tipicamente com MspI, que é insensível à metilação e corta em locais CCGG, enriquecendo regiões ricas em CpG do genoma. As extremidades dos fragmentos são então reparadas e adicionadas com dA, e os adaptadores são ligados. Subsequentemente, os fragmentos são selecionados por tamanho, convertidos por bisulfito, amplificados e sequenciados.

Figura 1. O fluxo de trabalho esquemático para RRBS.

2. Quais são os requisitos para sequenciar amostras?

Pode submeter células (pelo menos 5*10).⁶), tecidos frescos (pelo menos 2~3 g), ou ADN (pelo menos 5 μg; concentração ≥ 100 ng/µl; OD = 1.8~2.0; sem degradação ou contaminação por RNA ou degradação severa). Antes do envio, as células devem ser armazenadas a -80°C, e o ADN deve ser dissolvido em água e armazenado a -20°C. Por favor, evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Ao enviar, as amostras devem ser seladas com parafilme e mantidas em estado congelado, provavelmente com pacotes de gelo.

3. Quais espécies são adequadas para sequenciação de bisulfito de representação reduzida?

As espécies sujeitas a RRBS devem cumprir três requisitos: (i) eucariotos; (ii) o seu genoma de referência deve estar montado pelo menos ao nível de andaimes; (iii) anotações genómicas relativamente completas.

Mudanças na metilação do DNA induzidas por fotoperíodos longos e curtos em Nasonia

Revista: Pesquisa Genómica
Fator de impacto: 11,922
Publicado: 15 de dezembro de 2015

Resumo

Vespa Nasonia vitripennis é um organismo modelo emergente que exibe uma forte resposta fotoperiódica e pode ser utilizado para estudar os mecanismos moleculares subjacentes ao tempo fotoperiódico. Os autores tentaram descobrir como as fêmeas Nasonia controlar a trajetória de desenvolvimento da sua prole para sobreviver ao inverno, aproveitando o método RRBS. Mostrou que a redução da metiltransferase de DNA ou o bloqueio da metilação do DNA perturba amplamente a resposta de diapausa fotoperiódica das vespas, o que sugere o papel de Metilação do DNA na cronometragem fotoperiódica de insetos.

Materiais e Métodos

Resultados

1. O Nasonia metiloma

Os autores perfilaram a metilação do DNA no DNA genómico extraído de fêmeas. N. vitripennis mantidos em condições de dia longo ou curto através da utilização de RRBS. A metilação de CpG representa uma grande parte da sobreposição entre as duas amostras, em contraste com outros contextos de sequência (Figura 1B), o que pode sugerir que a metilação não-CpG representa em grande parte ruído experimental. Os CpGs parecem estar fortemente ou levemente metilados (Figura 1C). A maioria dos CpGs metilados estava localizada em exões, e a maioria estava localizada em íntrons, regiões promotoras e regiões intergénicas (Figura 1D, E).

Figura 1. O Nasonia metiloma.

2. Identificação de genes diferencialmente metilados

Os autores identificaram 51 locais de CpG diferencialmente metilados (DMCs) que foram mapeados para 37 genes. Aproximadamente metade dos DMCs (23/51) exibiu hipometilação em dias longos em comparação com dias curtos, enquanto os outros mostraram a tendência oposta. Foram realizados qPCRs para validar a análise de RRBS.

Figura 2. Metilação diferencial de DNA associada ao fotoperíodo em Nasonia.

3. Ensaios funcionais demonstrando um papel causativo da metilação do DNA

Os autores eliminaram Dnmt1a-c e Dnmt3 ao injetar dsRNA em pupas fêmeas de N. vitripennis strain AsymC. A redução foi verificada por qPCR. A redução de Dnmt1a levou a que as fêmeas produzissem descendência em diapausa, independentemente da duração do dia. O silenciamento de Dnmt3 resultou numa diferença não significativa (mas próxima da significância) na resposta de diapausa, sugerindo que o efeito de Dnmt3 é muito mais fraco ou mais difícil de resolver.

Eles também testaram o impacto da metilação do DNA farmacologicamente, utilizando o inibidor de metilação do DNA 5-aza-2'-desoxi-citidina (5-aza-dC), e observaram uma redução da diapausa na progénie de vespas mantidas em dias curtos, bem como um aumento na progénie de dias longos.

Figura 3. A metilação do DNA é necessária para a resposta de diapausa mediada pelo fotoperíodo.

Figura 4. Testes farmacológicos utilizando 5-aza-dC.

Conclusão

Os autores descobriram que a metilação do DNA em Nasonia vitripennis mudanças com o fotoperíodo sazonal. A interrupção de enzimas de metilação chave (Dnmt1a ou o uso de 5-aza-dC) altera a forma como as fêmeas respondem aos fotoperíodos. Os dados de metiloma de alta resolução mostram que os padrões de metilação de Nasonia são centrados no corpo do gene, semelhante a outros insetos. Isso confirma o papel da metilação do DNA na resposta ao fotoperíodo e sugere que diferentes metiltransferases têm funções distintas neste processo.

Referência:

1. Pegoraro M, Bafna A, Davies N J, et al.Mudanças na metilação do DNA induzidas por fotoperíodos longos e curtos em Nasonia. Pesquisa genómica, 2016, 26(2): 203-210.