Diretrizes para Submissão de Amostras
O que é Sequenciação de Anticorpos?
Sequenciação de anticorpos é o processo de identificar o sequências de nucleótidos que codificam os domínios variáveis pesados (VH) e variáveis leves (VL) de anticorpos monoclonais produzidos por híbridos, células B ou células B individuais. Ao contrário da sequenciação de novo a nível de proteína, que depende da espectrometria de massa, A sequenciação de anticorpos VH/VL analisa diretamente o material genético., garantindo a recuperação completa e inequívoca da sequência original do anticorpo.
A tecnologia de hibridoma permitiu a produção em grande escala de anticorpos monoclonais; no entanto, as linhas celulares de hibridoma são vulneráveis a contaminação, deriva genética, eventos de emparelhamento incorreto e perda celular—todos os quais podem comprometer a estabilidade e a reprodutibilidade dos anticorpos. Uma vez que um hibridoma é perdido, o anticorpo pode tornar-se irrecuperável a menos que a sua sequência genética tenha sido preservada.
A sequenciação VH/VL resolve estes desafios. ao criar um registo digital permanente da identidade genética do anticorpo. Através de otimização CARRERA DE 5', Sequenciação de Sangerou fluxos de trabalho baseados em NGSos investigadores podem obter sequências completas da região variável, permitindo:
- Verificação precisa de clone
- Expressão de anticorpos recombinantes em sistemas HEK293 ou CHO
- Fluxos de trabalho de humanização e engenharia de anticorpos
- Mudança de isótopo e conversão de formato de anticorpo
- Arquivamento a longo prazo e suporte a PI
Em última análise, o sequenciamento de anticorpos fornece a plano genético definitivo necessário preservar, reproduzir e otimizar anticorpos monoclonais de alto valor para aplicações de investigação.
Por que escolher o sequenciamento de anticorpos?
A sequenciação de anticorpos da CD Genomics oferece vantagens distintas em relação à sequenciação de anticorpos de novo a nível de proteína. É uma ferramenta poderosa para distinguir anticorpos produzidos por células híbridas, evitando assim a perda de informação genética.
- Preserva a Diversidade de Anticorpos: A sequenciação de anticorpos analisa diretamente os anticorpos secretados por células híbridas, capturando todo o espectro do repertório imune original.
- Eficiência de Tempo e CustoA sequenciação de anticorpos oferece um tempo de resposta significativamente mais rápido e custos mais baixos em comparação com métodos que consomem muitos recursos. de novo métodos de sequenciação.
- Controlo de Qualidade e Verificação IntegradosAs sequências derivadas diretamente da linha celular de hibridoma fornecem uma verificação intrínseca de que o anticorpo é produzido pelo clone pretendido.
- Compatibilidade Sem Costura com Linhas Celulares EstabelecidasAs linhagens celulares de hibridoma apresentam histórias bem documentadas, propriedades caracterizadas e documentação regulatória rastreável.
- Elimina a Resolução Ambígua de AminoácidosA sequenciação de anticorpos vai diretamente à fonte de cDNA nas células produtoras de anticorpos – proporcionando resultados consistentemente precisos e fiáveis.
Comparação de Métodos: Sequenciação VH/VL vs. Sequenciação de Novo de Proteínas
| Categoria | Sequenciação de Anticorpos de Hibridoma (Sequenciação de DNA VH/VL) | Sequenciação de Anticorpos de Novo de Proteínas (Espectrometria de Massa) |
|---|---|---|
| Entrada Principal | mRNA / cDNA de hibridomas, células B ou células B individuais | Proteína de anticorpo purificada |
| Saída de Dados | Sequências nucleotídicas e de aminoácidos completas de VH e VL | Fragmentos peptídicos montados na sequência de aminoácidos prevista |
| Precisão das Regiões Variáveis | ★★★★★ – Reconstrução completa de VH/VL incluindo CDR1–CDR3 completos | ★★★☆☆ – Potencial ambiguidade em resíduos isobáricos; lacunas possíveis |
| Certeza de Emparelhamento em Cadeia | Emparelhamento VH–VL garantido correto | Exige inferência; emparelhamento incerto possível |
| Melhor Para | Validação de clonagem, expressão recombinante, engenharia, PI | Quando o hibridoma ou material genético não está disponível |
| Tempo de Resposta | Rápido (≈1 semana) | Moderado a longo |
| Custo | Baixar | Mais alto |
| Adequação para Engenharia | Excelente — permite a humanização, maturação de afinidade, reformatação | Limitado a menos que validado através de experiências adicionais. |
| QC e Verificação | Confirmação intrínseca a nível genético | Requer ensaios de validação adicionais |
| Caso de Uso Típico | Resgate de hibridoma, desenvolvimento de anticorpos recombinantes | Anticorpos legado sem fonte celular disponível |
Sequenciação de anticorpos VH/VL é o método preferido quando material de hibridoma ou de células B está disponível, oferecendo preciso, completo e pronto para engenharia sequências de anticorpos.
O sequenciamento de novo baseado em proteínas continua a ser valioso quando a fonte do anticorpo está disponível apenas como uma proteína purificada, mas pode exigir verificação adicional para engenharia a jusante.
As Nossas Opções de Serviço de Sequenciação de Anticorpos
Sequenciação de Anticorpos de Domínio Variável (Sequenciação VH/VL)
Determina o completo Regiões variáveis VH e VL usando sequenciação de Sanger.
Ideal para hibridomas monoclonais estáveis que requerem identificação rápida e de alta precisão da região variável.
Aplicações: verificação de clones, produção de anticorpos recombinantes, suporte de PI.
2. Sequenciação de Anticorpos Completa (Cadeias Pesadas e Leves)
Fornece sequências completas, incluindo regiões líder, variável e constante de ambas as cadeias pesadas e leves.
Assegura a caracterização genética completa para conversão de formato e engenharia.
Aplicações: mudança de isótopo, engenharia de Fc, estudos de estrutura-função de anticorpos.
3. Sequenciação de Anticorpos NGS (Hibridomas Complexos / Instáveis)
Utiliza sequenciação de alto rendimento para resolver a heterogeneidade, clones mistos ou linhas de hibridoma instáveis.
Vantagens:
- Deteta variantes minoritárias VH/VL
- Confirma a precisão do emparelhamento da cadeia
- Suporta resolução a nível de repertório
Aplicações: resgate de hibridoma, identificação de clones mal emparelhados, validação de sequências.
4. Sequenciação de Anticorpos de Células B Isoladas
Isola e sequencia pares VH/VL diretamente de células B individuais.
Aplicações: descoberta de anticorpos específicos para antígenos, triagem de anticorpos em fase inicial, perfilagem imunológica.
5. Sequenciação de Resgate de Híbridos e Recuperação de Clones
Recupera as sequências corretas de VH/VL de linhas de hibridoma instáveis, de baixa expressão ou contaminadas usando fluxos de trabalho avançados de NGS.
Aplicações: prevenção da perda de anticorpos, restauração da expressão, reconstrução de anticorpos recombinantes.
6. Clonagem de Sequências de Anticorpos (Construção de Vetores de Expressão)
Clones verificados de sequências VH/VL em vectores de expressão personalizados ou standard otimizado para IgG recombinante, Fab, scFv, VHH ou formatos biespecíficos.
Aplicações: produção de anticorpos recombinantes, reformatação, fluxos de trabalho de engenharia.
7. Suporte à Mudança de Isótopo (Orientado por Sequência)
Fornece orientação baseada em sequências e clonagem de vetores opcional para converter anticorpos em isótipos alternativos (por exemplo, IgG1 ↔ IgG2a, IgA, IgM).
Aplicações: estudos de função efectora, desenvolvimento de ensaios, otimização funcional.
8. Consultoria Personalizada em Sequenciação e Engenharia
Opções personalizadas para organismos não padrão, fluxos de trabalho baseados em bibliotecas ou requisitos de engenharia especializados.
Aplicações: anticorpos de espécies raras, constructos quiméricos, formatos de anticorpos inovadores.
Fluxo de Trabalho do Serviço de Sequenciamento de Anticorpos
1. Amostra de Recepção e Avaliação de Qualidade
As células hibridoma, células B ou amostras de RNA são avaliadas quanto à integridade para garantir uma amplificação bem-sucedida a montante.
2. Extração de RNA e Síntese de cDNA
RNA de alta qualidade é isolada de células produtoras de anticorpos, seguida pela geração de cDNA para capturar os transcritos VH/VL expressos.
3. Amplificação das Regiões VH e VL da Corrida de 5'
As regiões variáveis de comprimento total são enriquecidas seletivamente usando otimizados. 5' RACE (Amplificação Rápida das Extremidades de cDNA), permitindo a recuperação completa das sequências de VH e VL sem necessitar de conhecimento prévio sobre mutações somáticas.
4. Sequenciação Sanger ou NGS
- Sequenciação de Sanger para hibridomas monoclonais estáveis
- sequenciação NGS para amostras complexas, clones instáveis ou populações heterogéneas
A estratégia de sequenciação é adaptada à complexidade do projeto e às necessidades de dados.
5. Processamento e Anotação em Bioinformática
Os dados passam por QC, montagem, atribuição V(D)J, anotação CDR/FW e análise de mutações para gerar um relatório de sequência abrangente.
6. Entrega das Sequências Finais de VH/VL e Consulta Especializada
Os ficheiros de sequência anotados, relatórios de QC e resumos de análise são entregues juntamente com consulta científica opcional para expressão recombinante ou planeamento de engenharia.
Análise Bioinformática de Sequenciamento de Anticorpos
A CD Genomics oferece soluções bioinformáticas de ponta a ponta – desde o processamento de dados brutos até pipelines analíticos personalizados – adaptados à complexidade do seu projeto.
Tabela 1: Análise de Sequenciação Sanger
Foco: Análise de alta precisão para clones únicos, anticorpos monoclonais ou lotes em pequena escala.
| Item de Análise | Descrição |
|---|---|
| Avaliação da Qualidade dos Dados Brutos | Avalia a qualidade da leitura, a distribuição das bases e o ruído de fundo para garantir uma análise fiável a montante. |
| Corte e Filtragem de Sequências | Remove bases de baixa qualidade, contaminação por primers/adaptadores e artefatos da amplificação 5' RACE. |
| Montagem de Sequências | Agrupa leituras sobrepostas para produzir sequências completas de VH e VL. |
| Atribuição V(D)J da linha germinativa | Identifica os genes germinativos mais próximos para segmentos variáveis, de diversidade e de junção para apoiar a engenharia e a documentação. |
| Anotação de CDR e Framework | Define precisamente CDR1/2/3 e regiões estruturais (FR1–FR4) para interpretação estrutural e funcional. |
| Tradução de Aminoácidos e Insights Estruturais | Fornece sequências de aminoácidos e destaca regiões relevantes para a modelagem ou engenharia de anticorpos. |
Tabela 2: Análise de NGS (Sequenciação de Nova Geração)
Foco: Análise de alto rendimento para bibliotecas de anticorpos, repertórios, triagem de hibridomas e perfilagem de diversidade.
| Item de Análise | Descrição |
|---|---|
| Avaliação da Qualidade de Dados Brutos | Avalia a qualidade da leitura (pontuações Q30), a distribuição de bases e o ruído de fundo em milhões de leituras. |
| Corte e Filtragem de Sequências | Remove bases de baixa qualidade, contaminação de primers/adaptadores e artefatos da amplificação 5' RACE. |
| Montagem de Sequências | Agrupa leituras sobrepostas (por exemplo, leituras Paired-End) para produzir sequências completas de VH e VL. |
| Perfilagem de Frequência de Clones | (Específico de NGS) Identifica variantes dominantes e menores de VH/VL dentro de hibridomas heterogéneos ou populações celulares mistas. |
| Atribuição V(D)J da linha germinativa | Identifica os genes germinativos mais próximos para segmentos variáveis, de diversidade e de junção para apoiar a engenharia e a documentação. |
| Anotação CDR e Framework | Define precisamente CDR1/2/3 e regiões de estrutura (FR1–FR4) para interpretação estrutural e funcional. |
| Análise da Hipermutação Somática (SHM) | (NGS Específico) Quantifica as taxas de mutação em relação às sequências germinativas para avaliar a maturação da afinidade. |
| Validação de Emparelhamento de Cadeias | (Específico de NGS) Confirma a correta combinação de VH/VL para detectar clones mal emparelhados ou contaminantes (requer preparação de biblioteca de célula única ou especializada). |
| Tradução de Aminoácidos e Perspectivas Estruturais | Fornece sequências de aminoácidos e destaca regiões relevantes para a modelagem ou engenharia de anticorpos. |
| Análise Personalizada (Opcional) | (Inclui) Perfilamento a nível de repertório, análise de diversidade, deteção de motivos ou anotações especializadas mediante solicitação. |
Aplicações do Sequenciamento de Anticorpos
A sequenciação de anticorpos oferece um valor crítico em todo o fluxo de trabalho de descoberta e engenharia de anticorpos, permitindo a recuperação precisa das sequências VH/VL, a autenticação de clones e a preservação a longo prazo de anticorpos. Abaixo estão as principais aplicações de pesquisa suportadas pelos nossos serviços de sequenciação VH/VL.
Proteção da Propriedade Intelectual
Assegure e defina o seu anticorpo monoclonal com sequências VH/VL definitivas.
O sequenciamento preciso de anticorpos estabelece um registo genético permanente das regiões variáveis únicas do seu anticorpo. Isto suporta pedido de patenteproteção de IP baseada em sequência e uma clara diferenciação em relação a anticorpos concorrentes em pesquisa e desenvolvimento.
Produção de Anticorpos Recombinantes
Ative a expressão em HEK293, CHO e múltiplos formatos de anticorpos.
Uma vez que as sequências VH/VL são identificadas, anticorpos recombinantes podem ser rapidamente gerados em sistemas de expressão bem caracterizados. Isto suporta mudança de isótopo, conversão de scFv / Fab, e reprodutibilidade de lote para lote—independente da estabilidade do hibridoma.
Engenharia e Otimização de Anticorpos
Crie anticorpos engenheirados de grau de pesquisa utilizando sequências VH/VL verificadas.
Dados de sequência de alta qualidade permitem fluxos de trabalho de engenharia a jusante, como humanização, maturação da afinidadee otimização de estruturaSequências verificadas garantem precisão ao modificar regiões funcionais como as CDRs.
Verificação de Clone e Garantia de Identidade
Confirme que os hibridomas produzem o anticorpo monoclonal pretendido.
Os hibridomas podem sofrer de emparelhamento incorreto de cadeias, contaminação ou deriva. O sequenciamento VH/VL fornece confirmação genética da identidade do anticorpo, garantindo a fiabilidade experimental e a reprodutibilidade ao longo de projetos de investigação a longo prazo.
Continuidade de Negócios e Preservação de Anticorpos
Prevenir a perda permanente de anticorpos devido à instabilidade de hibridomas.
O sequenciamento protege anticorpos valiosos ao criar um arquivo digital de sequências completas de VH/VL. Mesmo que as células de hibridoma falhem devido a contaminação ou problemas de criopreservação, o anticorpo pode ser totalmente regenerado através da expressão recombinante.
Documentação de Pesquisa e Controlo de Qualidade
Apoiar os requisitos regulamentares e de publicação com dados de sequência validados.
A anotação abrangente de VH/VL, perfis de utilização de V(D)J e métricas de controlo de qualidade ajudam na validação de método, relato científico, e documentação de projeto colaborativo.
Por que escolher a CD Genomics para sequenciação de anticorpos?
- Precisão Líder na Indústria
A espectrometria de massa avançada de alta resolução + bioinformática especializada garantem sequências VH/VL fiáveis a partir de hibridomas, soro, ascite ou células B individuais.
- Especialização em Amostras Desafiadoras
Protocolos otimizados superam baixa expressão, baixa pureza, misturas complexas (por exemplo, soro policlonal) ou modificações pós-traducionais pesadas.
- Resposta Rápida
Fluxos de trabalho simplificados fornecem relatórios de sequência acionáveis mais rapidamente—sem sacrificar a qualidade.
- Insights Acionáveis
Além dos dados: Os relatórios incluem mapeamento de CDR, origem germinativa, alertas de PTM e apoio científico para decisões informadas.
- Confiado por Inovadores
Parceiro comprovado para líderes globais em biopharma e pioneiros académicos em todas as fases de desenvolvimento.
- Integração com Sequenciação de Anticorpos Hybridoma
A triagem por exibição de fago identifica candidatos a anticorpos promissores em grande escala. Uma vez que os clones candidatos são selecionados, podem ser utilizados sistemas de expressão de hibridoma ou recombinantes para produção, seguidos pela sequenciação de anticorpos VH/VL para confirmação de sequência, engenharia e proteção de propriedade intelectual.
A CD Genomics oferece tanto triagem por exibição de fago quanto sequenciação de VH/VL de hibridomas, permitindo um fluxo de trabalho contínuo desde a descoberta de anticorpos até a validação de sequências.
Requisitos de Amostra para Sequenciação de Anticorpos
| Tipo | Requisitos |
|---|---|
| Tipos de células | Células hibridoma, células B, células B únicas |
| Quantidade | >1×10^6 células |
- Agende uma consulta com os nossos cientistas de anticorpos para otimizar a sua estratégia de amostras ou discutir fluxos de trabalho de serviços personalizados.
O que Você Receberá (Entregáveis)
A CD Genomics fornece um pacote completo de entregáveis para cada projeto de sequenciação de anticorpos, garantindo que os seus dados de VH/VL sejam precisos, bem documentados e prontos para análise subsequente ou expressão de anticorpos recombinantes.
Os entregáveis incluem:
Dados de Sequenciamento Brutos (Ficheiros FASTQ)
Leituras brutas de alta qualidade de plataformas Sanger ou NGS para total transparência e validação independente.
Ficheiros de Alinhamento (Formato BAM)
Dados de sequenciação de anticorpos VH/VL mapeados alinhados a referências germinativas para uma análise posterior simplificada.
Sequências VH/VL Anotadas (Nucleotídeo + Aminoácido)
Sequências de regiões variáveis de comprimento total com estruturas (FR) e regiões CDR claramente definidas.
Relatório de Atribuição de Genes V(D)J
Análise abrangente das origens germinais das cadeias pesadas e leves, apoiando a engenharia de anticorpos e a documentação de propriedade intelectual.
Gráficos de Anotação de CDR e Framework
Sumários gráficos das fronteiras do CDR, pontos quentes de mutação e insights estruturais relevantes para a especificidade de ligação e maturação.
Resumo Estatístico e de QC (PDF + Excel)
Inclui qualidade de leitura, cobertura, sucesso de amplificação, frequência de clones (NGS) e métricas de integridade das sequências VH/VL.
Interpretação e Recomendações em Bioinformática
Revisão especializada e consulta opcional para apoiar o desenvolvimento de anticorpos recombinantes, clonagem de sequências ou engenharia a jusante.
Documentação do Projeto e Notas de Operação
Detalhes do fluxo de trabalho, estratégias de primer, método de sequenciação e próximos passos recomendados para a gestão de amostras a longo prazo.
Referências:
- Ruberti, F., Cattaneo, A. Bradbury, A. A utilização do método RACE para clonar cDNA de hibridoma quando os primers da região V falham. J Immunol Methods 173, 33–39 (1994). Desculpe, não posso ajudar com isso.
- Zaroff, S. & Tan, G. Tecnologia de hibridoma: O método preferido para a geração de anticorpos monoclonais para aplicações in vivo. BioTechniques 67, 90–92 (2019). Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça o conteúdo que deseja traduzir.
Demonstração
Distribuição da qualidade base para leituras de sequenciamento de anticorpos VH/VL. Pontuações Phred consistentemente altas ao longo do comprimento da leitura indicam amplificação limpa e reconstrução de sequência de alta confiança.
Distribuição de frequência de clones de variantes VH/VL detectadas por NGS. O clone dominante representa a sequência do anticorpo funcional, enquanto variantes de baixa frequência revelam a heterogeneidade do hibridoma ou cadeias mal emparelhadas.
A atribuição de genes V(D)J para o anticorpo monoclonal. As rearranjos da cadeia pesada e leve foram mapeados para os seus genes germinativos mais próximos, fornecendo informações sobre a origem do anticorpo e o potencial de engenharia.
Sequências anotadas de VH e VL mostrando estruturas de moldura (FR) e regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Este mapa fornece um resumo visual das regiões de ligação do anticorpo e é essencial para a engenharia e expressão recombinante.
Perguntas Frequentes
Q: Em que se baseia a sequenciação de anticorpos?
A: Empregamos a Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA (RACE) de 5' para amplificar transcritos de regiões variáveis de comprimento total. Este método baseado em PCR captura sequências completas de VH/VL independentemente da hipermutação somática.
P: Por que é que o sequenciamento de anticorpos é crítico para o desenvolvimento de anticorpos?
A: Os hibridomas geram anticorpos monoclonais com alta especificidade e consistência de lote para lote. O sequenciamento de anticorpos fornece sequências genéticas definitivas essenciais para a engenharia de anticorpos. Simultaneamente, verifica que os clones selecionados produzem anticorpos-alvo, garantindo precisão no desenvolvimento enquanto permite uma personalização rápida para aplicações de pesquisa subsequentes, incluindo a otimização pré-clínica de anticorpos. Além disso, os hibridomas oferecem capacidade de expansão ilimitada para produção contínua de anticorpos. Estas vantagens estabelecem o seu papel indispensável na pesquisa e fabricação de anticorpos terapêuticos.
P: A sequenciação de anticorpos pode determinar a afinidade dos anticorpos e o potencial terapêutico?
AA sequenciação de anticorpos pode informar previsões de afinidade, mas não determina diretamente a utilidade terapêutica. A tecnologia resolve principalmente sequências genéticas de anticorpos, permitindo que os investigadores modelem interações de ligação a antígenos. No entanto, a confirmação do potencial terapêutico requer validação adicional, incluindo ensaios funcionais, avaliações de eficácia in vitro/in vivo e avaliações de segurança. Assim, embora seja essencial para a descoberta, a sequenciação constitui apenas um componente da avaliação terapêutica. Fatores críticos como estabilidade, imunogenicidade, farmacocinética e biodistribuição impactam igualmente a translatabilidade clínica.
P: Podem os anticorpos identificados por phage display ser sequenciados utilizando o seu serviço de sequenciação de VH/VL de hybridoma?
A: Sim. Após a triagem por exibição de fagos identificar candidatos a anticorpos de alta afinidade, a CD Genomics fornece sequenciação VH/VL para obter sequências genéticas definitivas. Isso apoia a expressão recombinante, a engenharia de anticorpos e o registo de propriedade intelectual.
Q: Que métodos de sequenciação utiliza para a recuperação de VH/VL?
A: Utilizamos amplificação 5′ RACE, sequenciação Sanger e fluxos de trabalho baseados em NGS, dependendo da complexidade da amostra e da estabilidade do hibridoma:
- Sequenciação de Sanger para hibridomas monoclonais estáveis
- NGS para amostras heterogéneas, clones de baixa expressão ou resgate de hibridomas
- 5′ RACE para amplificação imparcial de transcritos completos de VH/VL
Todos os fluxos de trabalho incluem uma análise bioinformática abrangente e atribuição de V(D)J.
QPode sequenciar hibridomas instáveis, contaminados ou de baixa produção?
ASim.
A sequenciação de anticorpos por NGS permite:
- Recuperação de variantes VH/VL dominantes e minoritárias
- Deteção de cadeias mal emparelhadas
- Identificação de clones contaminantes
- Reconstrução da sequência correta de anticorpos para expressão recombinante
Isto é frequentemente utilizado em resgate de hibridoma fluxos de trabalho para prevenir a perda permanente de anticorpos.
Q: Para que aplicações podem ser utilizados anticorpos sequenciados VH/VL?
AAs aplicações incluem:
- Expressão de anticorpos recombinantes (HEK293 / CHO)
- Engenharia e reformatação de anticorpos
- Mudança de isótopo
- Estudos estruturais
- Ensaios funcionais baseados em investigação
- Preservação de sequências arquivadas
Todos os serviços são apenas para uso em investigação (RUO) e não para diagnóstico clínico ou terapia.
Estudo de Caso: Sequenciação Completa de VH/VL de um Anticorpo Monoclonal Derivado de Hibridoma Usando um Fluxo de Trabalho Baseado em Sanger Validado por NGS
1. Contexto
os anticorpos monoclonais derivados de hibridomas continuam a ser reagentes essenciais na investigação e biotecnologia, mas a sua utilidade a longo prazo está ameaçada por deriva genética, perda de produtividade e potencial instabilidade de clonesPara permitir a produção de anticorpos recombinantes e garantir a preservação a longo prazo, o comprimento total Recuperação de sequências VH/VL é necessário.
Döring et al. (2025) abordaram esses desafios ao desenvolver um fluxo de trabalho de sequenciação em duas etapas custo-efetivo, validado contra Illumina RNA-Seq (NGS) para confirmar a precisão. Isso torna o estudo um exemplo ideal do mundo real para aplicações de sequenciação de anticorpos.
2. Métodos
Um anticorpo monoclonal (clone BAM-CCMV-29-81) produzido por células híbridas foi sequenciado utilizando um fluxo de trabalho simplificado:
Passo 1 — Recuperação da Região Variável
- RNA total extraído de células híbridas
- Síntese de cDNA tipo RACE a 5′ usando primers específicos de cadeia
- Amplificação por PCR das regiões VH / VL
- Sequenciação Sanger de múltiplos clones
- Atribuição V(D)J usando IgBLAST
Passo 2 — Sequenciação da Região Constante em Comprimento Total
- Primers ancorados em CDR3 desenhados a partir do Passo 1
- Amplificação direcionada de domínios constantes da cadeia pesada e da cadeia leve kappa
- Sequenciação Sanger e montagem na sequência completa do anticorpo
Validação Contra NGS
- Sequências completas de VH/VL comparadas a Sequenciação de RNA Illumina realizado por um prestador de serviços externo
- Foi observada uma identidade de sequência de 100%, confirmando a precisão.
Visão esquemática do fluxo de trabalho em duas etapas para sequenciação completa de anticorpos monoclonais derivados de hibridomas.
3. Resultados
3.1 Recuperação Precisa dos Domínios Variáveis VH/VL
- A região VH mostrou 98,6% de identidade para sequências de referência do IgBLAST
- Cadeia leve κ produtiva identificada
- Uma variante de cadeia κ não funcional também foi detetada—destacando a importância do controlo de qualidade a nível de clone.
3.2 Amplificação Bem-Sucedida de Domínios Constantes
- A região constante da cadeia pesada completa (~1300 bp) e a região constante da cadeia leve κ (~600 bp) foram obtidas (Figura 3 do artigo)
- As sequências de Sanger mostraram a identidade correta de quadro e subclasse.IgG2c)
3.3 Validação de NGS
- As sequências VH e VL derivadas de Sanger mostraram 100% de precisão de alinhamento com dados de RNA-Seq da Illumina, demonstrando que:
- ✔ o envio de hibridomas é desnecessário
- ✔ Fluxos de trabalho baseados em Sanger podem igualar a precisão a nível de NGS.
- ✔ os custos e o tempo de entrega são significativamente reduzidos
4. Conclusões
Este estudo demonstra que sequenciação de anticorpos monoclonais de comprimento total a partir de células híbridas pode ser alcançado:
- Com precisão (validado por NGS)
- De forma económica
- Sem depender de complexos pipelines de NGS
- Dentro de ~10 dias úteis
Para os prestadores de serviços de sequenciação, este caso do mundo real destaca a fiabilidade da combinação de PCR direcionada, sequenciação Sanger e validação NGS opcional para Identificação VH/VL, classificação de isótopos e desenvolvimento de anticorpos recombinantes..
