ddRAD-seq

Com a vasta proficiência da CD Genomics em sequenciação de nova geração (NGS)Estamos agora satisfeitos em oferecer serviços de Double Digest Restriction-site Associated DNA (ddRADseq) para a descoberta abrangente de SNPs em todo o genoma, mesmo na ausência de informações de sequência genómica prévias. O ddRADseq facilita o sequenciamento de dados em escala genómica de espécies não modelo, permitindo o desenvolvimento rentável de conjuntos de dados extensos que abrangem uma ampla amostragem taxonómica e geográfica.

O que é o sequenciamento ddRAD?

O ddRADseq ganhou considerável popularidade entre os ecologistas moleculares para o desenvolvimento de novos marcadores SNP utilizando plataformas de NGS. Este método aproveita a especificidade do local de corte das enzimas de restrição endonuclease para gerar fragmentos de biblioteca a partir de regiões genómicas distintas que são conservadas entre indivíduos da mesma espécie. Esta conservação permite o sequenciamento e a análise comparativa de regiões genómicas idênticas entre diferentes indivíduos. Consequentemente, o ddRADseq facilita o desenvolvimento rápido e eficiente de um número substancial de marcadores genéticos.

Qual é o Princípio da Sequenciação ddRAD?

ddRADseq é uma variação aprimorada do tradicional Sequenciação RAD protocolo, especificamente concebido para a descoberta de SNP e genotipagemEm vez de cisalhamento de fragmentos, o ddRAD-seq incorpora uma digestão secundária de restrição, aumentando assim tanto a ajustabilidade como a precisão da etapa de seleção de tamanho. Em resumo, o processo começa com a digestão do DNA genómico utilizando uma enzima de restrição, seguida pela ligação de um adaptador P1 com código de barras aos fragmentos resultantes. Estes fragmentos ligados ao adaptador de várias amostras são posteriormente agrupados, e uma segunda enzima de restrição é aplicada para uma digestão adicional. Os fragmentos digeridos são então submetidos a seleção de tamanho e purificação. Depois, os primers P2 são ligados, e os fragmentos são amplificados. Por fim, os dados de sequenciamento são analisados para avaliar e classificar as variações genéticas nas amostras de interesse.

Quais são as Vantagens do Serviço de Sequenciamento ddRAD

• Reutilização de Amostras: Múltiplas amostras podem ser reutilizadas, maximizando a eficiência dos recursos.
• Fluxo de Trabalho Eficiente: O processo de preparação da biblioteca é mais simples e rápido, otimizando o procedimento experimental geral.
• Comprimento de Fragmento Consistente: Garante comprimentos de fragmento uniformes entre amostras em locais de digestão idênticos, melhorando a precisão.
• Flexibilidade na Densidade de SNP: Oferece flexibilidade na densidade de SNP, permitindo personalização com base nas necessidades específicas da pesquisa.
• Alta Cobertura de Sequência: Alcança alta cobertura de sequência, melhorando a fiabilidade dos dados.
• Custo-Efetividade: Reduz os custos experimentais enquanto mantém uma robusta produção de dados.
• Nenhum Genoma de Referência Necessário: Permite a descoberta de SNPs sem a necessidade de um genoma de referência.
• Plataforma Avançada de Múltiplas Tecnologias: Fornece resultados de dados fiáveis, atendendo aos requisitos de fiabilidade e eficiência de custos.
• Suporte Técnico: Serviços de suporte abrangentes atendem a todas as necessidades do projeto, garantindo a satisfação do cliente.
• Processo Experimental Simplificado: Simplifica o processo experimental e garante uma rápida execução. Projetos de múltiplos locos podem ser realizados em ensaios multiplexados, com a tipagem concluída em um único tubo.
• Atualizações de Projeto em Tempo Real: Oferece atualizações em tempo real sobre o progresso do projeto, permitindo que os clientes acompanhem cada etapa de forma clara.
• Protocolos Personalizados: Flexibilidade para adaptar protocolos experimentais às necessidades específicas do projeto, com personalização especializada para resultados ótimos.

Aplicações da Sequenciação ddRAD

• Genética Populacional
• Estudos de Associação Genómica em Larga Escala (GWAS)
• Biologia da Conservação
• Biologia Evolutiva
• Mapeamento Genómico
• Programas de Reprodução

Fluxo de Trabalho de Sequenciamento ddRAD

O fluxo de trabalho de sequenciação ddRAD na CD Genomics envolve várias etapas-chave:

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra DNA genómico ≥300 ng, Quantidade Mínima: 100 ng, concentração ≥10 ng/µL As amostras de DNA requerem um OD260/280 o mais próximo possível de 1,8~2,0. Todo o DNA deve ser tratado com RNase e não deve apresentar degradação ou contaminação. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Illumina Hiseq, PE150 Profundidade de Sequenciamento: pelo menos 1x (amostras de montagem pelo menos 5x)
	Análise Bioinformática Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Pré-processamento de dados Alinhamento de sequências Chamadas de SNP Deteção de variantes Análise genética populacional Análise de associação Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em ddRAD-seq para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece um serviço completo de ddRAD-seq, tratando de tudo, desde os testes iniciais de qualidade do DNA até a análise detalhada de SNPs. Também oferecemos soluções personalizadas projetadas para se adequar às necessidades específicas do seu projeto. Para mais informações ou para discutir os seus requisitos, por favor, contacte a nossa equipa.

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão apresentados abaixo:

Perguntas Frequentes sobre ddRAD-seq

1. Quanto tempo leva a obter resultados do ddRAD-seq?

O tempo de resposta típico para os resultados do ddRAD-seq varia dependendo do tamanho e complexidade do projeto, mas geralmente oscila entre 4 a 8 semanas.

2. Podemos personalizar o serviço ddRAD-seq para necessidades específicas?

Sim, oferecemos soluções personalizadas para atender a requisitos únicos de projetos, incluindo ajustes de protocolo personalizados e opções de análise de dados.

3. Que tipos de amostras são adequadas para ddRAD-seq?

O ddRAD-seq pode ser aplicado a vários tipos de amostras, incluindo sangue, tecido e outras fontes de ADN genómico de plantas, animais e microrganismos.

4. Pode o ddRAD-seq ser utilizado sem um genoma de referência?

Sim, o ddRAD-seq não requer um genoma de referência, tornando-o adequado para espécies onde os genomas de referência não estão disponíveis.

5. Como escolher a tecnologia de genoma de representação reduzida apropriada?

Ao selecionar a tecnologia de genómica simplificada adequada, considere os seguintes quatro fatores para desenhar a sua estratégia de investigação:

Genoma de Referência

• Com Genoma de Referência: Utilizar um genoma de referência ajuda a reduzir erros devido a sequências homólogas ou repetitivas, facilita a análise de LD, análise de seleção, e GWASIsto é adequado para convencional. Sequenciação RAD e sequenciação PE151.
• Sem Genoma de Referência: recomenda-se ddRAD-seq.

Estratégia de Sequenciamento

• Digestão Dupla: Para fragmentos curtos, a sequenciação de extremidades pareadas (PE) pode resultar em uma sobreposição significativa de adaptadores e não é ideal para comprimentos de leitura longos; a sequenciação de extremidade única (SE) é recomendada para fragmentos curtos.
• Fragmentos Longos: Leituras longas podem detectar mais informações sobre variantes, mas requerem cobertura suficiente.
• Leituras Curtas: Melhora a profundidade de sequenciamento por local de restrição, aumentando a precisão na deteção de SNPs.
• Espécies Não Referência: A sequenciação SE é recomendada para evitar desperdício de dados.

Número de Marcadores

• Alta Densidade de Marcadores: O sequenciamento RAD convencional é adequado para análises que exigem marcadores de alta densidade.
• Genomas Complexos e Grandes Tamanhos de Amostra: GBS a sequenciação é ideal para genomas complexos e grandes volumes de amostras.

Artefactos de Amplificação por PCR

• Viés de PCR: Pode levar a que locais heterozigóticos sejam erroneamente identificados como homozigóticos ou introduzir erros. O sequenciamento RAD convencional pode remover duplicados de PCR utilizando informações de sequência de fragmentos, enquanto o GBS e o ddRAD-seq não conseguem.

Estudos de Caso ddRAD-seq

A genotipagem baseada em sequenciamento ddRAD para análise da estrutura populacional em tomate cultivado fornece novas informações sobre a diversidade genómica do germoplasma do tipo 'da serbo' de longa durabilidade da região mediterrânica. Pesquisa em Horticultura

Revista: Pesquisa em Horticultura

Fator de impacto: 5,404

Publicado: 01 de setembro de 2020

Fundo

TomateSolanum lycopersicum L..) é uma cultura vegetal económica vital com cultivo global. Pode-se traçar o início da domesticação do tomate à região andina da América do Sul, de onde se espalhou por toda a América. Durante o século XVI, os tomates foram introduzidos na Europa, com Espanha e Itália como principais pontos de entrada. Esta introdução desencadeou esforços adicionais de domesticação, contribuindo para o surgimento de uma diversidade genética local substancial. Consequentemente, a Bacia do Mediterrâneo na Europa é reconhecida como um centro secundário para a diversificação dos tomates. No contexto desta investigação, os autores utilizaram a tecnologia ddRAD-seq para explorar metódicamente a diversidade genética presente em várias variedades de tomate.

Materiais e Métodos

Resultados

Nesta investigação, a diversidade genética de 288 espécimes de tomate foi examinada, abrangendo 152 amostras da variedade de longa durabilidade (LSL) 'da serbo', originárias principalmente de Itália e Espanha, bem como outras variedades comuns de diversos países. Para além da característica LSL, as variedades 'da serbo' também apresentam características de tolerância ao stress. Para realizar o agrupamento hierárquico não paramétrico e modelar a estrutura populacional ancestral, o estudo encontrou 32.799 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) de alta qualidade. Seis subpopulações genéticas distintas foram delineadas, segregando efetivamente a maioria das variedades 'da serbo', refletindo a subestrutura populacional relacionada tanto ao tipo varietal quanto à origem geográfica. O desequilíbrio de ligação (LD) exibiu um rápido decaimento dentro de um intervalo genómico de menos de 5kb. A investigação de SNPs com alelos de baixa frequência (MAF) em materiais 'da serbo' revelou uma mutação de alta frequência em genes associados à tolerância ao stress, como CTR1 e JAR1, que estão implicados na maturação dos frutos. Finalmente, aproveitando uma seleção de 58 materiais centrais que representam uma parte significativa da diversidade genética, características essenciais foram ainda desenvolvidas. As assinaturas genéticas do germoplasma 'da serbo', cultivado com seleção na Bacia Mediterrânica, são reveladas neste trabalho. Além disso, fornece novas perspetivas sobre o germoplasma "da serbo" de longa duração, estabelecendo-o como uma rica fonte de genes de tolerância ao stress.

Fig. 1 Estimativa da diversidade genética em 288 acessos de tomate utilizando ddRAD.

Fig. 2 Decaimento do desequilíbrio de ligação (LD) e comparação.

Fig. 3 Gráfico de carregamento dos primeiros (F1) e segundos (F2) componentes principais mostrando a variação para as principais características da fruta em acessões do conjunto mini-core desenvolvido a partir de dados de SNP ddRAD de 288 genótipos de tomate cultivado.

Conclusão

Usando ddRAD-seq e o mais recente genoma do tomate, os autores identificaram 2.297 novos genes-alvo com SNPs no pool genético mediterrânico 'da serbo'. Este estudo revela uma distinção geográfica entre as variedades mediterrânicas e destaca SNPs em regiões genéticas novas relacionadas a vias de stress e hormonas. Uma coleção mini-core de genótipos diversos foi fornecida para melhoramento, oferecendo um valioso reservatório de genes para futuros melhoramentos de precisão e estudos de associação em todo o genoma.

Referência

1. Esposito, S., Cardi, T., Campanelli, G. et al. Genotipagem baseada em sequenciação ddRAD para análise da estrutura populacional em tomate cultivado fornece novas informações sobre a diversidade genómica do germoplasma de tipo 'da serbo' de longa duração de prateleira do Mediterrâneo. Horticultura Res 7, 134 (2020).