Sequenciação de DNA mitocondrial (mtDNA)

Disponível tanto na Illumina como na PacBio A CD Genomics oferece a solução de sequenciação de ADN mitocondrial precisa e acessível que procura.

Introdução ao Sequenciamento de mtDNA

O ADN mitocondrial (mtDNA) é um genoma compacto, circular e de dupla cadeia com 16.569 pb, contendo uma cadeia leve (L) rica em citosina e uma cadeia pesada (H) rica em guanina. As mitocôndrias desempenham um papel muito importante em funções celulares essenciais. Além de produzirem mais de 90% da energia necessária a uma célula, as mitocôndrias também geram espécies reativas de oxigénio (ROS) e participam na apoptose e em outras funções celulares importantes. O mtDNA mutante e o tipo selvagem podem coexistir como heteroplasmia e causar doenças humanas, incluindo cancro, doenças cardíacas, diabetes, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e hipertensão. Devido à considerável variabilidade clínica entre os distúrbios mitocondriais e muitos pacientes que apresentam fenótipos que se sobrepõem a doenças, muitas vezes o diagnóstico só pode ser confirmado pela identificação de uma variante patogénica de mtDNA através de testes genéticos moleculares de ADN extraído de uma amostra de sangue. O sequenciamento do ADN mitocondrial é uma ferramenta útil para os investigadores estudarem doenças humanas e também pode ser utilizado em genética populacional e avaliações de biodiversidade.

O sequenciamento de ADN mitocondrial está disponível tanto no MiSeq da Illumina como no Sistema PacBio Sequel. O sequenciamento de próxima geração (NGS) da Illumina tem o potencial de transformar a análise de mtDNA. Aproveite a vantagem de PacBioEm longas leituras, a CD Genomics apresenta sequenciação de mtDNA linearizado sem amplificação e de comprimento total. A sequenciação de comprimento total permite o emparelhamento de variantes ao longo de todo o genoma mitocondrial, a identificação de variantes heteroplasmáticas e a deteção de modificações epigenéticas que se perdem em métodos baseados em amplicões.

Vantagens do Nosso Serviço de Sequenciamento de mtDNA

• Eficiência de captura e alta cobertura, 100% de cobertura do amplicão de todas as regiões do genoma mitocondrial.
• Deteção mais precisa de variantes raras em mtDNA
• Novos programas e pipelines de análise bioinformática
• Pessoal bem experiente

Aplicação do Sequenciamento de mtDNA

• Análise de doenças relacionadas com as mitocôndrias
• Pesquisa sobre a evolução das espécies
• Pesquisa em sistemática e biologia evolutiva
• Pesquisa em genética populacional e biologia da conservação
• Pesquisa em genética humana
• Pesquisa sobre exposição ambiental e toxicologia

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de mtDNA

Especificações do Serviço

	Requisitos de amostra DNA genómico ≥ 0,4 µg, Concentração ≥ 20 ng/µl OD260/280=1.8-2.0
	Sequenciação Plataforma Illumina: Tamanho da biblioteca: 180-220 bp, PE 150, 1G Plataforma PacBio: Tamanho da biblioteca: 2 K, 1G MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400
	Análise de Dados Controlo de qualidade de dados Mapeamento de Genoma de Referência Deteção de SNP/InDel, anotação, estatísticas Deteção, anotação e estatísticas de heteroplasmia de mtDNA mapa cricoc do mtDNA …e mais

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de mtDNA para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece estratégias de sequenciação de DNA mitocondrial rentáveis. Estas incluem a preparação, sequenciação e análise aprofundada das sequências genómicas completas de DNA mitocondrial (mtDNA) derivadas de amostras de DNA intactas e puras. A nossa experiência permite alcançar uma sensibilidade, especificidade e precisão excecionais na identificação de mutações de mtDNA e na avaliação dos níveis de heteroplasmia. Para mais informações e um orçamento completo, não hesite em contactar-nos.

Referência:

1. Yao Y, Nishimura M, Murayama K, et al. Um método simples para sequenciar todo o genoma mitocondrial humano diretamente a partir de amostras e a sua aplicação em testes genéticos. Relatórios Científicos, 2019, 9(1): 17411.

Resultados de mapeamento e cobertura do sequenciamento de mtDNA, bem como a exibição de perfis patológicos de mtDNA. (Yao et al., 2019)

1. Por que são utilizadas sequências de mtDNA em vez de sequências de DNA autossómico?

O genoma mitocondrial apresenta uma infinidade de características distintas, incluindo altas variabilidades, evolução rápida e uma completa ausência de recombinação. O genoma mitocondrial é relativamente diminuto, e a taxa de mutação do DNA mitocondrial geralmente excede a do DNA cromossómico ao longo da evolução. Em organismos multicelulares, cada célula contém tipicamente múltiplas mitocôndrias, geralmente em maior número do que os núcleos celulares. Consequentemente, em comparação com o DNA nuclear, a extração de DNA mitocondrial a partir de amostras é consideravelmente mais viável, proporcionando uma quantidade amplificável de DNA para análises posteriores. Além disso, o genoma mitocondrial desempenha um papel crucial em certas doenças hereditárias.

2. O sequenciamento do genoma completo inclui o ADN mitocondrial?

Sequenciação do genoma completo tipicamente abrange o DNA mitocondrial (mtDNA). Apesar das diferenças notáveis em relação ao DNA nuclear, como o seu tamanho menor e a falta de recombinação, o mtDNA é comumente considerado como parte do sequenciamento do genoma completo. Os investigadores utilizam métodos e tecnologias de sequenciamento específicos durante o sequenciamento do genoma completo para garantir a integridade e a cobertura do mtDNA.

3. Quais são os desafios associados ao sequenciamento de mtDNA?

Em primeiro lugar, a abundância de ADN mitocondrial nas células pode potencialmente levar a problemas de contaminação. Isso é ainda agravado pela presença de heteroplasmia, onde múltiplas variantes de ADN mitocondrial coexistem dentro de um único indivíduo, adicionando complexidade à análise de dados. Além disso, a rápida evolução do ADN mitocondrial pode tornar os alinhamentos de sequências desafiadores entre diferentes espécies.

4. A amostra para sequenciação de captura mitocondrial humana é ADN ou mtDNA?

O técnica de sequenciação do mitocôndrio humano A captura utiliza sondas que visam especificamente as mitocôndrias, eliminando assim a necessidade de isolar o mtDNA. Consequentemente, o processo pode ser facilitado apenas com a disponibilização de amostras de sangue ou de DNA.

Controlo Genético sobre o mtDNA e a Sua Relação com o Transtorno Depressivo Maior

Revista: Biologia Atual
Fator de impacto: 9,494
Publicado: 21 de dezembro de 2015

Fundos

Estudos anteriores indicaram que a quantidade de DNA mitocondrial (mtDNA) sofre alterações em resposta a fatores de stress externos, sugerindo uma possível correlação com distúrbios associados ao stress, como os distúrbios de humor. Para explorar os mecanismos de regulação genética do mtDNA e a sua ligação com distúrbios de humor, realizámos uma análise utilizando dados de sequenciação do genoma completo de baixa cobertura de 10.442 pacientes chinesas Han com distúrbios de humor. Isto foi realizado com o objetivo de realizar um estudo de associação genómica (GWAS) sobre os níveis de mtDNA.

Métodos

Resultados

Este estudo utiliza dados de sequenciação de baixa cobertura de 10.442 mulheres chinesas para calcular a contagem de leituras padronizada mapeada ao genoma mitocondrial como um proxy para a quantidade de mtDNA. Dois loci que contribuem para os níveis de mtDNA foram identificados: um no gene TFAM no cromossoma 10 e o outro no gene CDK6 no cromossoma 7. Estes loci genéticos replicam-se dentro de uma matriz independente. O CDK6 emerge como uma nova molécula envolvida no controlo do mtDNA. A incidência de heteroplasmia aumenta em mulheres com distúrbios do humor, e esta escalada pode ser induzida pelo stress, como demonstrado usando um paradigma experimental em ratos. Além disso, pelo menos uma variante heteroplasmática correlaciona-se significativamente com flutuações na quantidade de mtDNA. Estas descobertas sugerem que tanto a contagem de cópias quanto as sequências do genoma mitocondrial desempenham papéis vitais na resposta ao stress de um organismo.

Figura 1. Dois Loci Associados ao mtDNA.

Figura 2. Contagens de Heteroplasmia em Ratos Stressados e de Controlo.

Conclusão

Os resultados desta pesquisa ilustram que loci próximos de TFAM e CDK6 podem instigar variações nas quantidades de mtDNA. Notavelmente, em casos graves de depressão, foram observadas acumulações de mutações dentro do DNA mitocondrial. Experimentos em modelos animais demonstraram a indução de heterogeneidade devido ao estresse crónico. Significativamente, a quantidade de mtDNA está associada à heterogeneidade específica de loci.

Referência:

1. Cai N, Li Y, Chang S, et al. Controlo genético sobre o mtDNA e a sua relação com o transtorno depressivo maior. Biologia Atual, 2015, 25(24): 3170-3177.