Análise do Local de Integração do Vírus Adeno-Associado (AAV)

Onde está o local de integração do genoma AAV?

Os vetores de Vírus Associados a Adenovírus (AAV) são conhecidos pela sua capacidade de transduzir transgenes de forma eficiente em várias células somáticas nos órgãos dos pacientes. Embora tradicionalmente considerados vetores episomais, os genomas de AAV podem integrar-se no genoma da célula hospedeira, com frequências de integração variando de 0,1% a 3% em vários tipos de células, como hepatócitos, fibroblastos, células musculares e neurónios. Hotspots de integração foram identificados em locais genómicos caracterizados por sequências palindrómicas, ilhas CpG, locais de início de transcrição (TSSs) e genes ativos.

Um local de integração significativo é o locus AAVS1, que está localizado dentro do gene PPP1R12C no cromossoma 19 do genoma humano. Este local é reconhecido pela sua capacidade de acomodar a inserção de genes exógenos enquanto mantém uma expressão genética estável, sem afetar negativamente a função celular normal e o desenvolvimento. Consequentemente, o AAVS1 é frequentemente referido como um local de "porto seguro", tornando-o um alvo ideal para edição genética e outras aplicações.

Como o AAV se integra

A integração do AAV no genoma do hospedeiro é um processo complexo que depende fortemente de fatores do hospedeiro, uma vez que os vetores AAV não codificam proteínas necessárias para a integração. A integração do AAV ocorre tipicamente em locais de quebras de dupla hélice (DSBs) ou cortes no genoma do hospedeiro. Esta integração pode ocorrer através de recombinação homóloga ou mecanismos de união de extremidades não homólogas. A presença de extremidades cromossómicas livres disponíveis para ligação com os genomas AAV sugere que proteínas nucleares envolvidas na resposta ao dano do DNA desempenham um papel crítico na regulação do processo de integração.

Embora estudos pré-clínicos e clínicos tenham indicado um perfil de segurança favorável para as integrações de AAV, permanecem preocupações quanto ao seu potencial genotóxico a longo prazo. Doses elevadas de AAV em modelos pré-clínicos têm sido associadas a carcinoma hepatocelular e expansões clonais devido à ativação de oncogenes. Consequentemente, enquanto a integração de AAV garante uma expressão sustentada do transgene e potenciais outros benefícios, também exige uma consideração cuidadosa das medidas de segurança.

Introdução à Análise do Local de Integração do AAV

A análise do local de integração do AAV é uma ferramenta de pesquisa crucial para entender as interações genómicas entre os vetores AAV e as células hospedeiras. Embora os vetores AAV persistam principalmente em estado episomal, uma parte do genomas virais pode integrar-se no genoma do hospedeiro, levantando questões sobre as preferências de inserção e os riscos potenciais.

A CD Genomics utiliza uma abordagem de alta resolução centrada na sequenciação de enriquecimento alvo baseada em captura híbrida de leituras curtas (TES). Este método utiliza sondas biotiniladas para capturar seletivamente fragmentos de junção AAV–hospedeiro a partir de DNA genómico fragmentado, permitindo a deteção sensível de inserções de comprimento completo e truncadas. Ao contrário dos métodos baseados em amplificação, o TES não requer extremidades genómicas intactas e fornece uma cobertura imparcial dos eventos de integração. Combinada com pipelines bioinformáticos personalizados, esta estratégia suporta um perfilamento preciso e de alto rendimento das paisagens de integração do AAV.

Vantagens do Serviço de Análise do Local de Integração de AAV

• Caracterização AbrangenteO serviço de Análise de Locais de Integração de AAV da CD Genomics permite a caracterização detalhada dos locais de integração de AAV, o que é essencial para compreender os efeitos a longo prazo dos vetores AAV no genoma do hospedeiro.
• Avaliação de Segurança AprimoradaAo identificar pontos quentes de integração e potenciais inserções oncogénicas, o nosso serviço ajuda a mitigar os riscos associados à mutagénese por inserção e garante a segurança.
• Estratégias OtimizadasAs percepções das análises dos locais de integração de AAV permitem o aprimoramento de abordagens, facilitando a entrega direcionada e minimizando os efeitos adversos associados à integração aleatória.
• Apoio à Conformidade RegulatóriaA análise abrangente do local de integração é cada vez mais necessária para submissões regulatórias. Os nossos serviços ajudam os clientes a cumprir os padrões regulatórios necessários.

Aplicações da Análise do Local de Integração do AAV

O serviço de Análise de Locais de Integração de AAV oferecido pela CD Genomics tem amplas aplicações em várias áreas, incluindo:

• Investigação em Oncologia: A análise dos locais de integração é crítica na investigação oncológica, particularmente na avaliação da genotoxicidade dos vetores AAV e do seu potencial para tumorigenese.
• Estudos de Imunologia: A integração de AAV pode ser utilizada para benefícios em aplicações imunológicas, como o aumento da funcionalidade das células T ou o tratamento de imunodeficiências.
• Modelos Animais: A análise do local de integração em modelos pré-clínicos fornece dados valiosos sobre os potenciais efeitos da administração de AAV e ajuda a prever resultados.

Fluxo de Trabalho de Análise de Localização de Integração de AAV

O DNA genómico é extraído de amostras de tecido ou células tratadas com AAV. As bibliotecas são construídas e enriquecidas utilizando captura híbrida baseada em leituras curtas TES que visam as junções AAV-hospedeiro. A sequenciação de pares de extremidades de 150 bp da Illumina é realizada para gerar uma cobertura de alta profundidade. Os dados são processados através de um pipeline personalizado para identificação de locais de integração, mapeamento de hotspots e análise de expansão clonal.

Especificações de Serviço

	Requisitos de Amostra gDNA>500 ng OD260/280=1,8 - 2,0 Sem degradação Nota: Os montantes de amostra são indicados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Sequenciação de enriquecimento de alvos baseada em captura híbrida Illumina NextSeq ou NovaSeq plataforma PacBio
	Análise Bioinformática Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade e corte de adaptadores Ler alinhamento aos genomas de referência do hospedeiro e AAV Deteção de leitura de fusão AAV-hospedeiro Análise da frequência do site de integração Agrupamento de hotspots e anotação genómica Perfilagem de expansão clonal Estimativa do número de cópias de vetor Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Dados brutos
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados

Referências

1. Dalwadi D A, Calabria A, Tiyaboonchai A, et al. Integração de AAV em hepatócitos humanos. Terapia Molecular, 2021, 29(10): 2898-2909.
2. Greig J A, Martins K M, Breton C, et al. Genomas vetoriais integrados podem contribuir para a expressão a longo prazo no fígado de primatas após a administração de AAV. Biotecnologia da Natureza, 2023: 1-11.
3. Henckaerts E, Dutheil N, Zeltner N, et al. A integração específica do sítio do vírus adeno-associado envolve duplicação parcial do locus alvo. Atas da Academia Nacional de Ciências, 2009, 106(18): 7571-7576.
4. Dyall J, Szabo P, Berns K I. Integração específica de sítio do vírus adeno-associado (AAV): Formação de junções AAV–AAVS1 em um sistema in vitro. Atas da Academia Nacional de Ciências, 1999, 96(22): 12849-12854.
5. Calabria A, Cipriani C, Spinozzi G, et al. A entrega intratímica de AAV resulta em integração terapêutica específica do local nos loci do TCR em camundongos. Blood, O Jornal da Sociedade Americana de Hematologia, 2023, 141(19): 2316-2329.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Referência

1. Dalwadi D A, Calabria A, Tiyaboonchai A, et al. Integração de AAV em hepatócitos humanos. Terapia Molecular, 2021, 29(10): 2898-2909.

1. Quais são os benefícios da análise do local de integração do AAV?

A análise do local de integração de AAV caracteriza padrões de integração, avalia a segurança, refina abordagens e apoia a conformidade regulatória.

2. Como é que a CD Genomics realiza a análise do local de integração do AAV?

O processo envolve a recolha de amostras, extração de ADN, preparação de bibliotecas, sequenciação, análise bioinformática e interpretação de dados.

3. Como é garantida a qualidade dos dados de sequenciação?

Medidas de controlo de qualidade, como o FastQC, são utilizadas para verificar a qualidade dos dados de sequenciação antes da análise.

4. A análise do local de integração pode prever potenciais preocupações de segurança?

A análise identifica pontos quentes de integração e potenciais inserções oncogénicas, ajudando a avaliar os riscos associados à mutagénese por inserção.

Genomas vetoriais integrados podem contribuir para a expressão a longo prazo no fígado de primatas após a administração de AAV.

Revista: Nature Biotechnology
Fator de impacto: 68,164
Publicado: 06 de Novembro de 2023

Fundo

As abordagens de AAV baseadas no fígado inicialmente alcançam uma alta expressão de transgene em primatas não humanos, mas experienciam uma diminuição ao longo de 90 dias, estabilizando-se em níveis mais baixos. O estudo revela que a expressão mediada por AAV envolve uma fase de curta duração a partir de genomas episomais e uma fase de longo prazo a partir de vetores integrados, com integrações genómicas detetadas em uma pequena fração de células.

Materiais e Métodos

Resultados

O estudo examinou os fatores que afetam a expressão do transgene em sistemas AAV no fígado utilizando macacos-rhesus e glicoproteína β-coriogonadotrópica (rh-β-CG) como transgene. Avaliou os vetores AAV8 e AAVrh10 através de biópsias hepáticas em vários momentos. Os resultados indicaram que os níveis de proteína rh-β-CG atingiram o pico precocemente e estabilizaram-se em níveis mais baixos, enquanto o DNA e o RNA do vetor diminuíram ao longo do tempo, com o RNA permanecendo estável nas avaliações posteriores.

Fig. 1: Pico inicial seguido por uma descida para níveis estáveis mais baixos de auto-transgene após administração intravenosa de vetores AAV a NHPs.

O estudo descobriu que os vetores AAV se integram no DNA cromossómico como estruturas concatemericas complexas, com altas frequências de integração observadas em hepatócitos não expressantes. Usando sequenciação de repetições terminais invertidas (ITR-seq), os investigadores identificaram eventos de integração no DNA do fígado, revelando uma distribuição generalizada pelo genoma, particularmente perto de genes do fígado altamente expressos. Notavelmente, nenhum dos locais de integração estava localizado em regiões associadas a mutações de carcinoma hepatocelular. Expansões clonais foram analisadas, indicando que os animais expostos a certos vetores tinham locais mais expandidos. Além disso, a sequenciação de leitura longa demonstrou uma diversidade de sequências de AAV in vivo, destacando rearranjos e truncamentos que provavelmente ocorreram após a administração.

Fig. 2: Localização do DNA do vetor integrado após administração intravenosa de vetores AAV a NHPs.

Fig. 3: Estrutura do DNA vetorial integrado após a administração intravenosa de vetores AAV a NHPs.

Conclusão

O estudo mostra que o AAV nos fígados de primatas é influenciado por respostas imunes e reparação do DNA. Domínios nucleares persistentes do DNA do vetor existem juntamente com a diminuição da expressão do transgene, indicando um potencial silenciamento. Integrações de baixa frequência sugerem que a expressão inicial depende de formas episomais. Melhorar a eficácia pode envolver a promoção da atividade episomal e a orientação das integrações para durabilidade.

Referência

1. Greig J A, Martins K M, Breton C, et al. Genomas vetoriais integrados podem contribuir para a expressão a longo prazo no fígado de primatas após a administração de AAV. Biotecnologia da Natureza, 2023: 1-11.