Sequenciação de Longas Leituras

A CD Genomics oferece tecnologias de ponta e serviços de análise bioinformática de sequenciação de leitura longa, que incluem Sequenciação SMRT da PacBio e Sequenciação por nanoporoOferecemos soluções de sequenciação precisas e rentáveis para investigação em humanos, animais, plantas e microrganismos.

O que é Sequenciação de Longas Leituras

A sequenciação de leitura longa, também conhecida como sequenciação de terceira geração, é um grupo em expansão. Sequenciação de DNA tecnologias que eliminam a necessidade de técnicas de sequenciação tradicionais, de clivagem e amplificação de ADN, e permitem a deteção simultânea de longas sequências de ADN de até 100.000 pares de bases. Os cientistas perceberam a importância das variantes estruturais no genoma humano. Algumas delas são variantes de inserção que excedem o comprimento de leitura de muitas tecnologias de sequenciação; algumas são regiões repetitivas que dificultam o alinhamento de sequências; e algumas são regiões ricas em GC, que frequentemente apresentam muitas inconveniências no estudo de variantes estruturais por métodos de sequenciação de leituras curtas.

Nos últimos anos, surgiram novas tecnologias que conseguem detectar sequências de leitura longa, proporcionando aos investigadores novas estratégias e ferramentas para a análise do genoma. Entre elas, as mais representativas e amplamente utilizadas são Sequenciação SMRT da PacBio e Sequenciação por nanoporoAs tecnologias de sequenciação de leitura longa podem produzir leituras muito longas, o que não é possível em sequenciação de próxima geração.

A PacBio lançou a plataforma de sequenciação de sequenciação em tempo real de moléculas únicas (SMRT), que utiliza uma célula de fluxo personalizada com muitos guias de onda em modo zero para sequenciar moléculas únicas em tempo real (ZMW). A polimerase está ligada ao fundo do poço e permite que a cadeia de ADN passe pelo ZMW. A imagem em tempo real de nucleotídeos marcados com fluorescência sintetizados juntamente com moléculas de template de ADN específicas é possível com a sequenciação SMRT. Quando a estrutura e a polimerase se separam, a reação de sequenciação está completa.

Os elementos centrais de A tecnologia da Nanopore dividir na formação de canais transmembrana a partir de nanoporos que permitem a passagem de correntes iónicas e a medição das alterações na corrente. Quando moléculas como o DNA ou o RNA passam através de nanoporos, causam uma interrupção na corrente. A informação sobre as alterações na corrente pode ser utilizada para identificar a molécula. Sequencia as moléculas de DNA/RNA inteiras diretamente.

Vantagens da Sequenciação de Longas Leituras

• Longas comprimentos de leitura média e alta precisão de consenso
• Precisão melhorada para sequências repetidas e variações no número de cópias
• Deteção mais precisa de um grande número de mutações
• Otimização do protocolo de extração de DNA em sequenciação de long-read
• Compatível com a análise de genoma e transcriptoma.
• Rápido e acessível

Aplicação de Sequenciação de Longas Leituras

• Função do gene: Concentre-se em amostras que apresentam funções específicas para revelar as principais causas de diferentes funções.
• Estrutura do gene: Splicing alternativo, APA, gene de fusão, SSR, previsão de CDS, identificação de TSS/TES, etc.
• Quantificação em comprimento total: Encontrar genes diferenciais abrangentes e eficazes e identificar genes funcionais.
• Epigenómica: Genoma completo direto e sequenciação do transcriptoma pode detectar modificações na base.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Longa Leitura

A CD Genomics utiliza várias plataformas para fornecer serviços de Sequenciação de Longa Leitura rápidos e precisos, bem como análise bioinformática. Os nossos especialistas altamente experientes executam a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados de alta qualidade. O fluxo de trabalho geral para a Sequenciação de Longa Leitura está descrito abaixo.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra gDNA, RNA Total, Tecido, Célula, et al. Por favor, seleccione a página de serviço de sequenciação de leitura longa apropriada com base nos seus objetivos. Cada página contém requisitos específicos para as amostras. Por exemplo, Sequenciação do Genoma Completo (PacBio), ADN Genómico ≥ 3 µg, Concentração ≥ 80 ng/µL Sequenciação do Genoma Completo (Nanopore), ADN Genómico ≥ 5 µg, Concentração ≥ 20 ng/µL Sequenciação de Plasmídeos (Nanopore), ADN Genómico ≥ 1 µg, Quantidade Mínima: 500 ng, Concentração ≥ 10 ng/µL Sequenciação de Amplicons de 16S/18S/ITS de Comprimento Total e Sequenciação Metagenómica de Longa Leitura Nota: Os montantes de amostra são indicados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Plataformas ONT, Biblioteca: 8K, 2G/por amostra Plataformas PacBio, biblioteca de 20 K
	Análise Bioinformática Chamamento de base Controlo de qualidade (FastQC / PycoQC / MinIONQC) Filtragem de leitura / aparo / remoção de adaptadores Montagem do Genoma Sequências de Consenso e Correção de Erros Chamadas de Variantes Análise de Variantes Estruturais Análise de SNP/CNV Análise da Regulação Genética Análise de Splicing Alternativo ...e mais Nota: Os dados de saída recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Visão geral das ferramentas e pipelines de análise de long-read. (Amarasinghe et al., 2020)

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na sequenciação de leitura longa para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece um pacote abrangente de serviços de sequenciação de long-read, incluindo preparação de amostras, construção de bibliotecas, Sequenciação SMRT e/ou Sequenciação por nanoporoe análise de bioinformática. Podemos adaptar este fluxo de trabalho ao seu interesse de pesquisa. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em entrar em contacto connosco.

Referência

1. Amarasinghe S L, Su S, Dong X, et al. Oportunidades e desafios na análise de dados de sequenciação de longas leituras. Biologia do genoma, 2020, 21(1): 30.

Usando resultados de sequenciação de genoma completo de célula única com leituras longas como exemplo. (Hård et al., 2023)

Referência

1. Hård J, Mold J E, Eisfeldt J, et al. Análise de genoma completo de leitura longa de células humanas únicas[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 5164.

Qual é a diferença entre o sequenciamento Illumina e o sequenciamento de leituras longas?

A sequenciação Illumina, conhecida como sequenciação de leituras curtas, produz leituras de sequência mais curtas, tipicamente entre 100 e 300 pares de bases. Por outro lado, as tecnologias de sequenciação de leituras longas, como as oferecidas por Oxford Nanopore Technologies e Pacific Biosciences, gerar leituras significativamente mais longas, que se estendem de milhares a dezenas de milhares de pares de bases. Esta variação no comprimento das leituras permite que o sequenciamento de longas leituras aumente a resolução de regiões genómicas intrincadas, incluindo sequências repetitivas e variantes estruturais, levando a uma compreensão genómica mais completa em comparação com o sequenciamento Illumina. A aplicação do sequenciamento de longas leituras ajuda imensamente na decifração de genomas bacterianos complexos, particularmente quando combinado com dados de leituras curtas da Illumina através de métodos de montagem híbrida.

2. Para quais áreas de investigação é adequada a sequenciação de long-read?

A sequenciação de leitura longa é aplicável a vários domínios de investigação dentro de genómica, incluindo genética humana, biologia evolutiva, microbiologia e botânica. Permite que os investigadores adquiram uma compreensão mais abrangente da estrutura e função do genoma, impulsionando assim os avanços nestas áreas.

3. Quais são as vantagens e desvantagens da plataforma PacBio?

O plataforma PacBio orgulha-se de uma alta precisão a nível de molécula única, com mais de 90% das sequências a atingir uma pontuação de qualidade (Q) superior a 30, e oferece dados de sequenciação com uma precisão de alinhamento que ultrapassa a de NGS plataformas. Além disso, oferece um comprimento médio de leitura que ultrapassa NGS plataformas em mais de duas ordens de magnitude. No entanto, as suas desvantagens incluem custos de sequenciação significativamente mais altos em comparação com plataformas como a Novaseq, elevadas despesas com equipamentos e a incapacidade de interpretar dados de sequenciação em tempo real, falhando assim em atender às exigências de cenários que requerem alta pontualidade.

4. Quais são as vantagens e desvantagens da tecnologia ONT?

As vantagens de tecnologia ONT reside na sua elevada pontualidade de sequenciação e custos de sequenciação relativamente mais baixos em comparação com os plataforma PacBioAlém disso, o seu comprimento médio de leitura ultrapassa o de NGS plataformas em mais de duas ordens de magnitude. No entanto, as suas desvantagens decorrem de erros sistemáticos na deteção de sinais, como dificuldades na identificação de homopolímeros de base, resultando em diferenças significativas tanto na precisão de molécula única como na precisão de alinhamento em comparação com plataformas PacBio e NGS. Estas limitações restringem as suas aplicações.

A paisagem da variação estrutural genómica nos australianos indígenas

Revista: Nature
Fator de impacto: 45,16
Publicado: 13 de dezembro de 2023

Fundo

A Austrália alberga centenas de nações aborígenes, cada uma com uma rica diversidade cultural e linguística. Apesar da extensa documentação do seu património cultural, a diversidade genómica dos australianos indígenas está subexplorada, com uma representação significativamente baixa nas bases de dados genómicas globais. O Centro Nacional para a Genómica Indígena (NCIG) aborda esta lacuna ao envolver comunidades aborígenes em investigação genómica ética e liderada pela comunidade. Neste estudo, foi realizada uma sequenciação de long-read em escala populacional em comunidades aborígenes usando Oxford Nanopore Technologies, revelando variações genómicas e variantes estruturais previamente inexploradas, que são cruciais para o avanço da medicina genómica.

Métodos

Resultados

A referência completa do genoma T2T-chm13 foi utilizada para avaliar a mapeabilidade e a deteção de variantes estruturais (SV), demonstrando a superioridade do alinhamento e da deteção de SV pela ONT. Isto revelou 159.912 SVs únicos e 136.797 grandes indels, e identificou 11 variantes de número de cópias (CNVs) de alta confiança por indivíduo, destacando os benefícios da sequenciação de leituras longas para um perfil genómico detalhado.

Fig. 1 Sequenciação de long-read em comunidades indígenas australianas.

Para caracterizar a variação estrutural genómica, os autores categorizaram as variantes por tipo, tamanho e contexto. A maioria das variantes (84,9%) eram sequências repetitivas, incluindo STRs, TRs e inserções/deleções de elementos móveis. As CNVs eram menos numerosas, mas cobriam regiões significativas do genoma. As variantes estavam distribuídas de forma desigual, com maior densidade perto dos telómeros, particularmente SVs associados a TRs. O tamanho variava conforme o tipo, com TR-SVs sendo maiores do que STRs e SVs não repetitivos. Os SVs de elementos móveis mostraram picos de tamanho correspondentes a grandes famílias de repetição como Alu, L1 e SVA. Muitas SVs eram únicas para este estudo, especialmente dada a inclusão de comunidades australianas sub-representadas e o uso de sequenciação de leitura longa. Comparando os SVs deste estudo com bases de dados globais, os autores encontraram cerca de 38% de similaridade com SVs anotados, indicando uma alta proporção de SVs novos.

Fig. 2 Paisagem da variação estrutural genómica.

Os autores analisaram variações estruturais genómicas (SVs) entre australianos indígenas e não indígenas, constatando que a maioria das SVs era privada ou polimórfica. Notavelmente, 48,5% das SVs eram únicas para indivíduos indígenas, enquanto 9,2% eram únicas para indivíduos não indígenas. As SVs únicas em indivíduos indígenas eram frequentemente não anotadas e específicas de comunidades particulares. As distinções genéticas eram evidentes, com agrupamentos distintos para diferentes comunidades na análise de coordenadas principais, e as SVs partilhadas entre indivíduos indígenas eram raras, sublinhando a sua diversidade genómica única.

Fig. 3 Distribuição de SVs em indivíduos Indígenas e não Indígenas.

Fig. 4 Distribuição de SVs entre comunidades indígenas.

Conclusão

Este estudo revela a paisagem de variação estrutural dos australianos indígenas utilizando sequenciação de long-read, revelando variações diversas únicas a esta população. Isto sublinha a necessidade de dados de referência específicos para a ancestralidade na medicina genómica. Destacamos a heterogeneidade genética entre as comunidades indígenas e fornecemos insights sobre padrões mais amplos de variação estrutural genómica em populações humanas, particularmente em repetições em tandem curtas (STRs), que têm implicações para o diagnóstico e tratamento de doenças.

Referência

1. Reis, A.L.M., Rapadas, M., Hammond, J.M. et al. A paisagem da variação estrutural genómica nos australianos indígenas. Natureza 624, 602–610 (2023).