Identificação Microbiana

O que é Identificação Microbiana

A identificação microbiana envolve o rigoroso processo de diferenciação entre várias categorias de microrganismos—abrangendo bactérias, leveduras e bolores—e a determinação do seu género, espécie ou estirpe utilizando estruturas de classificação estabelecidas. Este processo envolve uma caracterização detalhada de microrganismos desconhecidos com base na análise de características fenotípicas e genotípicas.

Apesar do seu tamanho microscópico, os microrganismos desempenham um papel fundamental nos ecossistemas. Contribuem significativamente para a biodiversidade em vários ambientes, incluindo solo, água e ar. Além disso, têm profundas implicações para a saúde humana, participando em processos benéficos como a digestão e a regulação do sistema imunitário, ao mesmo tempo que estão implicados em resultados adversos, incluindo infeções e doenças. Assim, a deteção, estudo e identificação destes microrganismos continuam a ser imperativos para avançar na nossa compreensão dos seus papéis e impactos.

Métodos de Identificação Microbiana

Métodos Tradicionais

A identificação microbiana tradicionalmente baseia-se em características fenotípicas, incluindo a morfologia celular, reações bioquímicas e requisitos específicos de crescimento. Especificamente, estes métodos abrangem:

• Análise de Ácidos GordosEste método identifica microrganismos com base nos seus perfis únicos de ácidos gordos.
• Utilização de Fontes de CarbonoAqui, avalia-se a capacidade dos microrganismos de metabolizar várias fontes de carbono.
• Determinação de Mol% (G+C)Esta técnica classifica microrganismos avaliando o conteúdo de guanina-citosina no seu DNA.
• Análise de APIEnsaios bioquímicos padronizados são utilizados para determinar espécies microbianas.

Embora eficazes, estes métodos tradicionais podem ser trabalhosos e demorados, exigindo um esforço manual extenso.

Técnicas de Identificação Rápida

Com os avanços na tecnologia, as técnicas de identificação rápida oferecem uma identificação microbiana mais eficiente e precisa. Estes métodos proporcionam tempos de resposta mais rápidos e uma maior precisão. As principais técnicas incluem:

• Hibridização DNA-DNA: Oferecendo uma precisão superior em comparação com a determinação de mol% (G+C), a hibridização DNA-DNA baseia-se no princípio de que, quando a homologia da hibridização DNA-DNA excede 70%, a espécie pode ser identificada com precisão.
• Sequenciação do Gene 16S rRNAEsta metodologia serve como uma ferramenta poderosa para a identificação bacteriana. Ao analisar a sequência do gene 16S rRNA em amostras microbianas e compará-la com uma biblioteca de sequenciamento genético verificada, a CD Genomics pode determinar as identidades bacterianas tanto a nível de género como de espécie, fornecendo resultados rápidos e fiáveis.
• Sequenciação 18S/ITSPara a identificação de fungos, particularmente leveduras e bolores, utiliza-se o sequenciamento 18S/ITS. Esta técnica é tanto eficiente como precisa para identificar fungos a nível de género e espécie.

• Sequenciação do Genoma Completo (WGS)O WGS fornece uma análise genética detalhada ao sequenciar todo o genoma de um microrganismo, ajudando a distinguir espécies estreitamente relacionadas e a compreender variações genéticas.

• MetagenómicaA metagenómica envolve o sequenciamento de material genético diretamente de amostras ambientais, permitindo o estudo de comunidades microbianas, incluindo aquelas que não podem ser cultivadas.
• MALDI-TOF MS (Espectrometria de Massa por Desorção a Laser Assistida por Matriz e Tempo de Voo)Este método avançado permite a identificação fiável de bactérias e leveduras. Comparado aos métodos fenotípicos tradicionais, o MALDI-TOF MS oferece maior precisão e tempos de resposta mais rápidos.

Os Nossos Serviços de Identificação Microbiana

CD Genomics fornece os seguintes serviços avançados de identificação microbiana:

• Sequenciação de SangerUtiliza sequências de genes rRNA para uma identificação microbiana precisa, aproveitando uma vasta base de dados para corresponder sequências e identificar bactérias e fungos com precisão.

• MetagenómicaSequencia material genético diretamente de amostras ambientais, permitindo o estudo de comunidades microbianas diversas e não cultiváveis, e proporcionando uma visão abrangente dos ecossistemas microbianos.
• Sequenciação do Genoma Completo MicrobianoAnalisa todo o genoma de microrganismos para distinguir espécies intimamente relacionadas e resolver ambiguidades de classificação através de perfis genéticos detalhados.
• Sequenciação de Amplicões 16S/ITS/18SUtiliza tecnologias de sequenciação de próxima geração, incluindo a sequenciação de leitura longa da PacBio, para uma análise de alta resolução da diversidade microbiana e identificação a nível de estirpe, superando os métodos tradicionais.

Seleção de Plataformas e Protocolos de Sequenciação

Em geral, a precisão da identificação de espécies melhora com leituras de sequenciamento mais longas. No entanto, considerações práticas, como as capacidades da plataforma de sequenciamento e os custos, muitas vezes exigem uma escolha da plataforma de sequenciamento e das regiões de amplificação com base nos objetivos específicos do estudo.

• Os métodos tradicionais de sequenciação de primeira geração são conhecidos pela sua alta precisão, custo relativamente baixo e longas extensões de leitura, que podem quase cobrir toda a extensão do gene 16S rRNA. No entanto, estes métodos são limitados pela sua incapacidade de analisar diretamente amostras mistas ou complexas, resultando em uma menor taxa de sequenciação.
• Tecnologias de sequenciação de segunda geração oferecem alta capacidade de processamento, custos reduzidos e a capacidade de realizar preparação de bibliotecas e sequenciação em amostras mistas. Isso torna-os um método predominante na pesquisa de sequenciação de amplicões 16S. No entanto, estas tecnologias são limitadas por comprimentos de leitura mais curtos, normalmente necessitando da amplificação de regiões específicas como V1–V3, V3–V4 ou V4–V5, seguidas de sequenciação em extremidades pareadas (PE250 ou PE300).
• As tecnologias de sequenciação de terceira geração mais recentes oferecem comprimentos de leitura ultra-longos e alta capacidade de processamento, facilitando a aquisição de sequências do gene 16S rRNA de comprimento total com facilidade. Apesar destas vantagens, estão limitados por taxas de erro mais elevadas e custos, o que atualmente restringe a sua aplicação generalizada. No entanto, com os avanços e aperfeiçoamentos contínuos, as tecnologias de sequenciação de terceira geração estão prestes a tornar-se um método comum na investigação microbiana no futuro.

Vantagens dos Nossos Serviços de Identificação Microbiana

• Alta Vazão e PrecisãoA CD Genomics utiliza plataformas de sequenciação de alto rendimento de última geração, nomeadamente o Illumina NovaSeq 6000, para garantir resultados de sequenciação precisos e fiáveis. O nosso equipamento avançado é capaz de processar grandes volumes de amostras de forma eficiente, facilitando assim tempos de resposta acelerados.
• Identificação Microbiana AbrangenteA nossa gama de serviços abrange a identificação de um amplo espectro de microrganismos, incluindo bactérias, fungos e arqueias. A nossa extensa base de dados de sequências genómicas permite a identificação precisa da maioria das espécies microbianas, aumentando assim a fiabilidade dos nossos resultados.
• Gestão de Qualidade RobustaAdherimos rigorosamente a um sistema de gestão de qualidade que fundamenta a precisão e a fiabilidade de cada resultado de teste. A automação nos nossos processos mitiga erros manuais e reforça a consistência nas análises.

Aplicação da Identificação Microbiana

• Estabelecimento de Bibliotecas MicrobianasA identificação precisa de microrganismos é fundamental para a criação e manutenção de bibliotecas microbianas. Estes repositórios servem como recursos essenciais para a investigação científica, permitindo o estudo e a comparação de diversas espécies microbianas.
• Triagem de Comunidades Microbianas FuncionaisA identificação de microrganismos que exibem funções biológicas específicas—como a produção de enzimas, a produção de ácidos ou a síntese de antibióticos—é crítica para inúmeras aplicações industriais. Este rastreio funcional permite a utilização direcionada de comunidades microbianas para alcançar resultados desejados.
• Desenvolvimento de Produtos MicrobianosNo contexto do desenvolvimento de produtos microbianos, como na produção de probióticos ou biofertilizantes, a identificação precisa de microrganismos benéficos é fundamental. Esta precisão garante tanto a eficácia como a segurança dos produtos finais, facilitando a sua aplicação bem-sucedida.
• Monitorização AmbientalA identificação microbiana é também um componente fundamental dos esforços de monitorização ambiental, ajudando na deteção e rastreio da contaminação microbiana em amostras de água, solo e ar. Esta informação é indispensável para manter a saúde ambiental e salvaguardar a segurança pública.
• Controlo de Qualidade Alimentar e FarmacêuticoNos domínios da produção alimentar e farmacêutica, garantir a ausência de microrganismos nocivos é de extrema importância. A identificação rigorosa de contaminantes microbianos ajuda a monitorizar e controlar potenciais contaminações, assegurando assim a segurança do produto e a conformidade regulatória.

Fluxo de Trabalho de Identificação Microbiana

O fluxo de trabalho de identificação microbiana na CD Genomics envolve várias etapas-chave:

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Amostra de DNA ≥150 ng, Concentração ≥5 ng/μL Amostras ambientais ≥5 g Métodos diferentes têm requisitos específicos de amostra, que podem ser verificados nas respetivas páginas de serviço. As amostras de ADN requerem um OD260/280 o mais próximo possível de 1,8~2,0. Todo o DNA deve ser tratado com RNase e não deve apresentar degradação ou contaminação. Nota: Os montantes de amostra são indicados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Illumina NovaSeq 6000, e Volume de Dados de Sequenciamento: NGS > 50.000 leituras, Sequenciamento de terceira geração > 10.000 leituras
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Avaliação de dados brutos Filtragem Alinhamento Identificação Classificação Nota: Os dados de saída recomendados e os conteúdos da análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Identificação Microbiana para a sua escrita (personalização)

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

A distribuição da taxonomia de todas as amostras no nível de classificação do Filo.

Mapa de calor da abundância de espécies.

Curva de rarefação das leituras sequenciadas para amostras (A figura acima) & A profundidade das amostras de sequenciação (A figura abaixo).

Análise de boxplot baseada em bray Curtis (A), jaccard binário (B), unifrac não ponderado (C) e unifrac ponderado (D).

Análise PCoA baseada em Bray-Curtis (A), Jaccard binário (B), unifrac não ponderado (C) e unifrac ponderado (D).

Árvore de agrupamento UPGMA.

Proporção média do grupo tratado e do grupo de controlo.

Cladograma.

PONTUAÇÃO LDA.

Perguntas Frequentes sobre Identificação Microbiana

1. Como Selecionar o Método de Sequenciação Apropriado?

A escolha do método de sequenciação correto depende dos objetivos da pesquisa e dos tipos de amostras envolvidos. Por exemplo, Sequenciação de Sanger é adequado para estirpes puras cultivadas, sequenciação metagenómica é ideal para estudar a diversidade de amostras ambientais complexas, enquanto sequenciação do genoma completo oferece informações genómicas detalhadas para diferenciar espécies estreitamente relacionadas.

2. Como são apresentados os Resultados?

Os resultados são tipicamente apresentados num formato de relatório abrangente, que inclui anotações de espécies, árvores filogenéticas, resultados de previsões funcionais e várias visualizações de dados. O relatório pode incluir estatísticas sobre divisões de sequências, gráficos de barras dos níveis de anotação, gráficos de barras da análise LEfSe LDA, diagramas de Venn, mapas de calor dos índices de diversidade beta e redes de interação entre espécies.

3. Como devo preparar as minhas amostras para submissão?

Assegure-se de que as amostras estão devidamente rotuladas e armazenadas de acordo com as diretrizes fornecidas. Para amostras ambientais, utilize recipientes estéreis e preserve as amostras para evitar contaminação. Instruções detalhadas estão disponíveis nas nossas páginas de serviço.

4. Por que é essencial a identificação bacteriana precisa?

A identificação bacteriana precisa é fundamental para programas de monitorização ambiental (MA) nas indústrias de fabricação de produtos farmacêuticos e outros produtos regulamentados. O processo de identificação de isolados desconhecidos serve como um passo inicial crucial na avaliação dos riscos potenciais que os microrganismos representam para o ambiente de fabricação, o produto final e, em última instância, para os pacientes. Serviços eficazes de identificação bacteriana, que oferecem soluções de rastreamento e análise de dados de MA, são vitais para manter uma compreensão clara da flora microbiana de uma instalação. Isso permite a deteção precoce de qualquer atividade microbiana incomum, proporcionando assim uma oportunidade para uma remediação atempada.

Estudos de Caso de Identificação Microbiana

Aproveitar o microbioma radicular do milho para identificar bactérias que promovem o crescimento em condições de frio.

Revista: Microbioma

Fator de impacto: 16,837

Publicado: 18 de abril de 2020

Fundo

O milho enfrenta problemas de rendimento em climas mais frios devido a temperaturas de arrefecimento. Para abordar esta questão, os investigadores analisaram como o stress de arrefecimento afeta o microbioma radicular do milho e identificaram bactérias benéficas que poderiam melhorar o crescimento sob stress. Eles analisaram o microbioma radicular utilizando tecnologias de sequenciação profunda e selecionaram uma coleção de endófitos de milho para avaliar os seus efeitos promotores de crescimento em condições de arrefecimento.

Materiais e Métodos

Resultados

Dois experimentos identificaram comunidades bacterianas chave na endosfera radicular de milho cultivado em solo de campo e em vasos. Ambas as condições mostraram microbiomas distintos, com Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes e Actinobacteria a serem predominantes. Foram observadas diferenças na abundância, nomeadamente em Actinobacteria e Oxalobacteraceae, entre o milho cultivado em campo e em vasos. O estudo destaca como as condições de crescimento afetam a composição do microbioma radicular.

Fig. 1. Identificação das principais famílias da endosfera radicular de milho cultivado em campo e em vaso.

Temperaturas frias alteram significativamente o microbioma do endosfera radicular do milho, com mais de 40% da variância atribuída a mudanças de temperatura. O impacto é mais pronunciado na endosfera radicular do que no solo em massa, onde famílias bacterianas específicas como Chitinophagaceae e Blastocatellaceae apresentam mudanças notáveis.

Fig. 2. Alterações na comunidade bacteriana após tratamento com temperatura de refrigeração nos experimentos IV e V.

Conclusão

As plantas estabelecem um microbioma radicular estável principalmente a partir do solo circundante, com condições de frio a causarem alterações bacterianas mais significativas nas raízes do que no solo em massa. As estirpes de PGPR identificadas, que prosperam na endosfera radicular, mostram-se promissoras para promover o crescimento do milho em temperaturas frias e serão exploradas mais a fundo para uso agrícola.

Referência

1. Beirinckx S, Viaene T, Haegeman A, et al. Aproveitar o microbioma radicular do milho para identificar bactérias que promovem o crescimento em condições de frio. Microbioma, 2020, 8: 1-13.