Sequenciação de CircRNA

Para apoiar a recente emergência da pesquisa em RNA circular (circRNA), a CD Genomics está a oferecer o serviço de sequenciação de circRNA que utiliza as mais recentes plataformas Illumina para uma caracterização rápida, económica e precisa.

A Introdução da Sequenciação de CircRNA

CircRNA é um novo membro dos RNAs não codificantes (ncRNAs), gerado por backsplicing não sequencial de exões, íntrons ou ambos. Eles são caracterizados pela sua estrutura de laço fechado covalentemente, faltando assim tampões de 5' e caudas de poli-A de 3'. Os circRNAs são formas altamente estáveis de ncRNAs devido às suas propriedades de resistência a nucleases. Quando foram identificados pela primeira vez na década de 1970, os circRNAs eram considerados genomas virais ou subprodutos de eventos de splicing incorreto. No entanto, pesquisas recentes revelaram que os circRNAs são evolutivamente conservados em plantas, animais e seres humanos, e que os circRNAs têm funções biológicas importantes.

As circRNAs podem atuar como esponjas de miRNA e cumprir uma função regulatória na expressão génica. Notavelmente, uma ampla gama de circRNAs está anormalmente expressa em contextos de doenças específicas, o que sugere a sua associação com a ocorrência e desenvolvimento de doenças humanas. Os circRNAs também desempenham múltiplas funções em processos celulares, incluindo modelos para tradução, regulação de splicing alternativo e expressão génica, andaimes para a montagem de complexos proteicos e moduladores da biogénese de rRNA e tRNA. Adicionalmente, podem ser utilizados para aumentar a ativação imunológica para fins terapêuticos antivirais devido à sua intervenção na regulação imunológica e na infecção viral.

A deteção abrangente de circRNAs a partir de dados de transcriptoma de alta produtividade é um passo inicial e crucial para estudar a sua biogénese e função. O sequenciação de alto rendimento A utilização de RNA de rRNA/RNA linear-depletado em combinação com ferramentas computacionais levou à identificação de milhares de novas circRNAs e à análise dos seus transcritos hospedeiros lineares de forma quantitativa em diversos organismos. Ao contrário dos miRNAs e de outros pequenos RNAs, as circRNAs não são facilmente separadas de outras espécies de RNA por tamanho ou mobilidade eletroforética. Consequentemente, são geralmente retidas em bibliotecas depletadas de rRNA e enriquecidas em bibliotecas tratadas com RNase R, que apenas digere RNA linear.

Vantagens da Sequenciação de CircRNA

• Identifica circRNAs conhecidos e novos
• Permite o perfilamento de circRNAs em uma ampla gama dinâmica.
• Explora novos biomarcadores e redes regulatórias de circRNAs.

Aplicações da Sequenciação de CircRNA

A sequenciação de circRNA pode ser utilizada para, mas não se limita a, as seguintes pesquisas:

• Investigação dos mecanismos patogénicos de doenças como o cancro;
• Exploração das alterações na regulação da expressão genética durante o crescimento e desenvolvimento;
• Investigação de outros aspectos relacionados com a transcrição genética e a regulação da expressão.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de CircRNA

O fluxo de trabalho geral para a sequenciação de circRNA está descrito abaixo. Para construir a biblioteca de sequenciação de circRNA, o primeiro passo é a depleção de rRNA, seguida pela digestão de RNA linear e preparação de biblioteca específica de fita. A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais.

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra RNA total ≥ 5 μg, Quantidade Mínima: 2 μg, Concentração ≥ 50 ng/µl Células ≥ 2×106 Tecido ≥ 500 mg, Quantidade Mínima: 100 mg Relação OD A260/A280 ≥ 1,8, relação A260/230 ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar livres de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciamento Preparação de biblioteca específica de fita Illumina HiSeq PE150 Mais de 80% das bases com um score de qualidade ≥Q30
	Análise de Dados Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade de dados brutos Mapeamento baseado em referência Identificação e anotação de circRNA Análise da expressão de circRNA conhecidos e novos Análise de expressão diferencial, análise de enriquecimento e análise funcional Análise de origem de circRNA, incluindo previsão de miRNA alvo e análise da rede de interação circRNA-miRNA. Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de CircRNA para a sua escrita (personalização)

Apoiado pelos nossos cientistas experientes e tecnologia avançada, a CD Genomics pode ajudá-lo a adquirir a informação de sequência de circRNA com resolução de base única de uma só vez através do sequenciação de alto rendimento por um rigoroso controlo de qualidade e análises avançadas de bioinformática. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, sinta-se à vontade para contacte-nos.

Referência:

1. Wang M, Yu F, Wu W, et al.ARNs circulares: Um novo tipo de RNA não codificante e as suas potenciais implicações na imunidade antiviral. Revista Internacional de Ciências Biológicas, 2017, 13(12): 1497.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciação

Distribuição de A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

1. Como é gerada a circRNA?

As circRNAs são geralmente geradas através da retro-splicing de exões numa ordem não sequencial. A circularização do RNA pode ser gerada por sequências repetitivas para facilitar o retro-splicing de exões não sequenciais.

Figura 1. Biogénese de CircRNA (Fischer & Leung 2016).

2. Por que usar tecnologia de alto rendimento para analisar circRNAs em vez de microarrays?

Sequenciação de alto rendimento é um método que poupa tempo e custos, com muitas vantagens em relação ao DNA. microarranjos.

i. Detecção de novos transcritos. Microarrays dependem da hibridização com sondas específicas de espécies ou transcritos que estão restritas a circRNAs conhecidos. No entanto, Sequenciação de RNA pode detectar transcritos novos, fusões de genes, variantes de nucleotídeo único, pequenas inserções e deleções, e outras alterações previamente desconhecidas.

ii. Maior gama dinâmica. As microarrays são limitadas pelo fundo na extremidade inferior e pela saturação do sinal na extremidade superior, enquanto o sequenciamento de RNA pode quantificar contagens de leitura de sequenciamento discretas e digitais, oferecendo uma gama dinâmica mais ampla.

iii. Aumento da sensibilidade e especificidade. Comparado a microarranjos, o sequenciamento de RNA oferece uma sensibilidade e especificidade aumentadas, permitindo uma deteção melhorada de genes, transcritos e expressão diferencial.

iv. Detecção de transcritos de baixa abundância e raros. A profundidade de cobertura de sequenciamento pode ser facilmente aumentada para a deteção de transcritos raros, transcritos únicos por célula ou genes fracamente expressos.

3. Existem dicas para construir um vetor de expressão de circRNA?

Sim. Sequências para a circularização e sequências que ativam a circularização são necessárias para construir um vetor de expressão de circRNA que transporta circRNAs.

Referência:

1. Fischer J W, Leung A K L. CircRNAs: um regulador do stress celular. Revisões críticas em bioquímica e biologia molecular, 2017, 52(2): 220-233.

CircHLA-C desempenha um papel importante na nefrite lúpica ao sequestrar miR-150.

Revista: Terapia Molecular: Ácido Nucleico
Fator de impacto: 6,392
Publicado: 12 de janeiro de 2018

Resumo

Os RNAs circulares participam na patogénese de múltiplas doenças ao atuarem como miARNs esponjas. Os estudos anteriores relataram que o miR-150 estava positivamente correlacionado com o índice de cronicidade renal em pacientes com nefrite lúpica (NL). Os autores investigaram ainda o perfil de circRNA renal e a interação entre circRNAs e miR-150 em pacientes com NL. O bioinformática A análise previu que o miR-150 era regulado pelo circHLA-C e que o circHLA-C provavelmente desempenhava um papel importante na patogénese da LN ao sequestrar o miR-150.

Materiais e Métodos

Resultados

1. Perfil e características dos circRNAs em biópsias renais de pacientes com LN

Um total de 18505 transcritos de circRNA foram identificados, incluindo 11411 circRNAs regulados para cima e 7094 circRNAs regulados para baixo. O mapa de calor de clustering hierárquico mostrou que os níveis de expressão dos circRNAs estavam agrupados entre biópsias renais de LN e rins de controlo normal. 171 circRNAs foram encontrados a expressar-se de forma significativamente diferente entre o grupo de LN e o grupo de controlo normal.

Figura 1. O perfil e características das circRNAs. (A) Mapa de calor agrupado. O vermelho representa circRNAs sobre-regulados e o verde representa circRNAs sob-regulados. (B) Gráfico de vulcão. (C-F) As características das circRNAs expressas diferencialmente.

2. A rede de interação entre CircRNAs e miRNAs

A rede de interação entre CircRNAs/miRNAs foi prevista através de sequências de correspondência de sementes conservadas. Revelou que todos os 40 circRNAs continham os seus respetivos elementos de resposta a miRNAs (MREs). Os cinco principais miRNAs regulados por cada um dos 40 circRNAs foram exibidos como uma rede (Figura 2).

Figura 2. A rede de interação entre circRNAs e miARNs.

3. Previsão de funções e vias

As funções das circRNAs diferencialmente expressas foram previstas através da análise de GO e KEGG. A análise de enriquecimento de GO revelou que os papéis funcionais dos genes hospedeiros-alvo estavam ligados a processos biológicos, componentes celulares e funções moleculares. A análise de KEGG encontrou 23 vias relacionadas às funções de 142 circRNAs regulados para cima, e tanto a via de sinalização do fator induzível por hipoxia-1 (HIF-1) como a via de sinalização de neurotrofinas participaram na regulação da expressão de NF-kB.

Figura 3. Funções previstas dos circRNAs superexpressos em LP.

4. Interacção entre circHLA-C e miR-150

CircHLA-C correlacionou-se positivamente com os parâmetros da atividade da doença LN. E o miR-150 exibiu uma tendência de correlação negativa com o circHLA-C (Figura 4).

Figura 4. A interação entre o circHLA-C renal e o miR-150 na LN.

Conclusão

Os autores identificaram 171 circRNAs diferencialmente expressos e validaram sete circRNAs significativamente upregulados nos rins de pacientes com LN classe IV, com circHLA-C a correlacionar-se positivamente com a atividade da doença LN. circHLA-C foi significativamente aumentado enquanto miR-150 foi diminuído, exibindo uma correlação negativa e uma correspondência perfeita na sequência de ligação. O estudo também forneceu o primeiro perfil de circRNAs renais e a rede de interação entre circRNAs e miRs em LN.

Referência:

1. Luan J, Jiao C, Kong W, et al.O circHLA-C desempenha um papel importante na nefrite lúpica ao sequestrar miR-150. Terapia Molecular-Ácidos Nucleicos, 2018, 10: 245-253.