Diretrizes para Submissão de Amostras
O que é Sequenciação Metatranscriptómica
A sequenciação metatranscriptómica fornece uma instantânea em tempo real da atividade genética dentro de comunidades microbianas. Em vez de analisar quais genes estão presentes (como na metagenómica), este método foca-se no que genes estão ativamente expressos sob condições específicas—revelando o comportamento microbiano, regulação e produção metabólica. Quer esteja a estudar o microbioma intestinal ou um sistema de fermentação industrial, a metatranscriptómica responde à pergunta:
"O que é que os micróbios estão a fazer neste momento?"
Como funciona:
- Extrair RNA total da amostra (por exemplo, fezes, solo, tecido)
- Remover o RNA ribossómico (rRNA) para enriquecer o RNA mensageiro (mRNA)
- Converter mRNA em DNA complementar (cDNA)
- Construir bibliotecas de sequenciamento e realizar sequenciamento de alto débito.
- Analisar padrões de expressão génica para revelar funções microbianas ativas
Fluxo de Trabalho de Sequenciação Metatranscriptómica.
Por que escolher o sequenciamento metatranscriptómico?
Esta técnica de próxima geração oferece insights funcionais profundos que os métodos baseados em DNA não conseguem fornecer. Em vez de simplesmente identificar quem está aí, revela o que eles estão a fazer.
- Visão Direta sobre a Função Microbiana
Quantifica a expressão génica em todos os domínios microbianos—bactérias, arqueias, fungos e vírus. - Deteção Abrangente e Livre de Cultura
Ao contornar a necessidade de cultivo, o método captura a dinâmica comunitária do mundo real entre todos os micróbios, incluindo espécies não cultiváveis. - Análise Dinâmica e Resolvida no Tempo
Compare a expressão génica ao longo de pontos temporais ou condições de tratamento para identificar alterações funcionais ou potenciais biomarcadores. - Suporta a Descoberta Mecanística
Combinado com bases de dados de vias como o KEGG, ajuda a reconstruir rotas metabólicas e redes regulatórias. - Compatível com Multi-Ómicas
Integra-se perfeitamente com metagenómica, transcriptómica do hospedeiro e metabolómica para uma interpretação biológica mais profunda.
Como se Compara com Outras Ferramentas de Microbioma?
| Técnica | O que Detecta | Reflete a Atividade Funcional? | Resolução | Melhor Para |
|---|---|---|---|---|
| Amplicão 16S/ITS | Genes marcadores de bactérias/fungos | ❌ Não | Médio (Género/Espécie) | Triagem rápida, perfilagem taxonómica |
| Metagenómica | Todo o DNA microbiano (taxonomia + funções potenciais) | ❌ Não (potencial funcional apenas) | Alto (Nível de Tensão) | Identificação de espécies e potenciais capacidades metabólicas |
| Metatranscriptómica | RNA microbiana expressa ativamente | ✅ Sim | Alto (Nível de Gene + Estirpe) | Perfilagem de expressão, estudos de mecanismos, descoberta de biomarcadores |
| Anfitrião Transcriptómica | Expressão de RNA hospedeiro | ✅ Sim | Alto | Estudos de interação hospedeiro-microbiota |
Fluxo de Trabalho do Serviço de Sequenciamento Metatranscriptómico de Ponta a Ponta
Serviço simplificado desde a amostra até aos resultados—maximizando a qualidade e a eficiência.
Definir objetivos
Confirmar fluxo de trabalho
Registar amostras
QC de RNA
Extração de RNA (opcional)
Remover rRNA (>90%)
Construir bibliotecas com índices duplos
Realizar QC da biblioteca
Illumina / MGI leituras curtas
Leituras longas PacBio
Profundidade personalizável
QC de Dados
Análise do transcriptoma
Anotação funcional
Geração e entrega de relatórios
Visão Geral da Estratégia de Sequenciação Metatranscriptómica
Tipos de Amostras Suportados:
- Fezes, tecido, saliva, swabs e mais
Destaques da Construção da Biblioteca:
- >90% depleção de rRNA
- Indexação dupla única
- Validação de qualidade rigorosa
Plataformas de Sequenciação:
- Illumina NovaSeq X: 150 bp PE – perfilagem de expressão ampla
- MGI DNBSEQ-G400100/150 bp PE – transcriptómica rentável
- PacBio Sequel IIe: 15–25 kb HiFi – resolução a nível de isoforma
Profundidade Recomendada:
- Padrão: 5–10 Gb/amostra
- Opcional: Maior profundidade para transcritos de baixa abundância
Métricas de Qualidade de Dados:
- >80% bases a Q30+
- Taxa de erro <0,1%
- Resultados precisos e fiáveis
Análise Bioinformática Metatranscriptómica
Completo análise de dados desde leituras brutas até visuais prontos para publicação, apoiando as suas necessidades de investigação e financiamento.
Perfilagem de Expressão Microbiana
- Perfil de expressão genética ativa em bactérias, fungos, vírus e arqueias.
- Visualizar a abundância de espécies e métricas de diversidade
Anotação Funcional e Análise de Vias
- Anotar genes chave usando UniRef e UniProt.
- Reconstruir vias metabólicas com KEGG e MetaCyc
- Realizar análise de expressão diferencial de vias.
Deteção de Resistência a Antibióticos e Virulência
- Detetar genes de resistência a antibióticos (AMR) e fatores de virulência.
- Quantificar a expressão e analisar a enriquecimento de vias.
Visuais e Relatórios Prontos para Publicação
- PCA de alta qualidade, mapas de calor, gráficos de vulcão e mais
- Análise estatística incluindo LEfSe para diferenças funcionais chave
- Dados de expressão normalizados e fornecidos em tabelas fáceis de usar.
Requisitos de Amostra para Sequenciação Metatranscriptómica
Para garantir um desempenho de sequenciação ótimo, as amostras devem cumprir padrões de quantidade e pureza básicos. Consultoria personalizada está disponível para tipos de amostras especializadas.
| Tipo de Amostra | Requisitos Mínimos |
|---|---|
| RNA total | ≥ 4 μg (≥ 3 μg mínimo), ≥ 50 ng/μL |
| Células Cultivadas | ≥ 5 × 10⁶ células |
| Amostras Ambientais | ≥ 1,5 gramas |
📩 Não tenho certeza se a sua amostra é adequada? Contacte-nos para orientação personalizada antes do tratamento.
A Metatranscriptómica é Adequada para a Minha Pesquisa?
A sequenciação metatranscriptómica revela o que o seu microbioma está realmente a fazer, não apenas quem está presente. Se o seu estudo envolve atividade microbiana, dinâmicas de expressão génica ou alterações em vias funcionais, esta técnica pode ser uma escolha perfeita.
Casos de Uso Ideais:
- Estudos sobre Microbioma em Saúde e Doença
Acompanhar como os microbiomas intestinal, cutâneo ou respiratório se comportam em estados saudáveis ou doentes. - Intervenções com Fármacos, Dieta ou Ambiente
Quantificar como os tratamentos impactam a expressão génica microbiana e as vias metabólicas. - Ecologia Microbiana Ambiental e Agrícola
Avalie as funções ativas dos micróbios em solos, águas ou sistemas associados a hospedeiros. - Desenvolvimento de Terapêuticas Probioticas e do Microbioma
Identificar estirpes benéficas e validar os seus mecanismos funcionais em ação. - Descoberta de Micróbios Incultiváveis
Detectar a expressão ativa de organismos difíceis de cultivar que foram ignorados por métodos tradicionais.
Perguntas de Pesquisa Comuns que Ajudamos a Responder:
- Como é que a atividade genética microbiana muda em resposta a um tratamento ou condição?
- Quais genes ou vias são ativados após uma intervenção dietética ou farmacêutica?
- Posso descobrir novas funções em micróbios que não podem ser cultivados no laboratório?
- Como posso caracterizar funcionalmente estirpes para o desenvolvimento de probióticos ou biomarcadores?
Combine Metatranscriptómica com Outras Ómicas para Obter Insights Mais Profundos
| Técnica Emparelhada | Vantagem Combinada | Exemplo de Aplicação |
|---|---|---|
| Metagenómica + Metatranscriptómica | Identificar tanto a atividade genética potencial como a real | Diferenciar estirpes silenciosas e ativas em comunidades microbianas. |
| Anfitrião Transcriptómica Metatranscriptómica | Decifrar redes de interação hospedeiro-microbio | Investigar modelos de inflamação/infeção |
| Metabolómica + Metatranscriptómica | Ligar a expressão génica ao resultado metabólico real | Explorar o impacto de medicamentos/dieta no metabolismo microbiano |
| 16S/ITS + Metatranscriptómica | Ecrã de grandes coortes, depois aprofunde-se em amostras ativas. | Triagem eficiente de amostras antes da caracterização funcional profunda |
Por que escolher a CD Genomics para sequenciação metatranscriptómica?
Quando se trata de capturar a expressão genética microbiana com precisão e profundidade, a CD Genomics oferece mais do que apenas sequenciação—nós fornecemos insights acionáveis apoiados por anos de experiência e suporte completo.
- Experiência Extensa em Multi-Ómicas
Confiados por institutos de investigação de topo e empresas de biotecnologia, trazemos um sólido histórico em transcriptómica, genómica e perfilagem do microbioma. - Opções de Plataforma Flexíveis
Escolha entre as plataformas Illumina, MGI ou PacBio para corresponder ao seu tipo de amostra, orçamento e necessidades de resolução. - Análise Bioinformática Personalizada
Obtenha insights mais profundos através de análises avançadas, incluindo anotação funcional, enriquecimento de vias e mapeamento de expressão diferencial. - Controlo de Qualidade Rigoroso em Cada Etapa
Desde o manuseio de amostras até à elaboração do relatório final, o nosso sistema de rastreabilidade de ponta a ponta garante resultados fiáveis e reproduzíveis. - Apoio Especializado do Início ao Fim
A nossa equipa técnica oferece orientação e resolução de problemas em tempo real, ajudando-o a acelerar prazos e a superar desafios do projeto.
Resultados da Demonstração
Os resultados parciais estão mostrados abaixo:
A distribuição da taxonomia de todas as amostras no nível de classificação de Filo.
Mapa de calor da abundância de espécies.
Curva de rarefação das leituras sequenciadas para todas as amostras.
Análise de boxplot com base em bray Curtis (A), jaccard binário (B), unweighted unifrac (C) e weighted unifrac (D).
Análise PCoA baseada em Bray-Curtis (A), Jaccard binário (B), unifrac não ponderado (C) e unifrac ponderado (D).
Árvore de agrupamento UPGMA baseada em unifrac não ponderado (A) e unifrac ponderado (B).
Boxplot de TPM para cada amostra.
Gráfico de correlação do número de genes.
Resultados estatísticos da anotação GO para CLC_vs_SLC.
Classificação KEGG de CLC_vs_SLC.
Estatísticas de funções específicas de base de dados com anotações comuns e únicas.
Classificação de funções CAZy.
Perguntas Frequentes sobre Sequenciação Metatranscriptómica
1. Quais são as questões notáveis das amostras de RNA?
A contaminação deve ser rigorosamente excluída durante a amostragem. Em detalhe, os instrumentos e consumíveis relacionados com a amostragem devem ser esterilizados e livres de RNase. As amostras obtidas recentemente devem ser imediatamente congeladas, colocando-as em azoto líquido, ou enviando diretamente as amostras ambientais ou clínicas originais para nós. A quantidade total de RNA recomendada para envio é de 6 µg ou mais, com uma concentração superior a 50 ng/µl.
2. Que tipo de métodos de controlo de qualidade (QC) você adota para as amostras do cliente?
Faremos QC nas suas amostras de RNA total antes de as sequenciar. Utilizamos o Agilent Bioanalyzer para determinar o Número de Integridade do RNA (RIN). Se o RIN for inferior a 8, as amostras não passarão no QC. O QC da biblioteca também será realizado utilizando o Agilent Bioanalyzer para determinar o tamanho e a pureza da biblioteca. Além disso, antes de carregar as bibliotecas no sequenciador, realizamos a quantificação por qPCR. O custo para isto está incluído no serviço de sequenciação. Os dados brutos passarão pelo nosso filtro Q30, o que significa que mais de 80% das bases têm uma pontuação de qualidade superior a Q30.
3. Quais são as vantagens da metatranscriptómica?
Metatranscriptómica é a análise genómica de transcriptomas microbianos completos, fornecendo uma fonte de dados particularmente rica sobre a diversidade global de vírus de RNA e a sua história evolutiva. A metatranscriptómica tem várias vantagens em relação a métodos tradicionais, como cultura celular, PCR de consenso, e metagenómica abordagens baseadas na purificação de partículas virais.
A metatranscriptómica tem-se mostrado bem-sucedida na caracterização dos viromas de RNA de diversos invertebrados. Especificamente: (i) revela o viroma de RNA completo, com cobertura suficiente para montar genomas virais completos, incluindo aqueles de parasitas co-infectantes; (ii) oferece uma quantificação e avaliação fiáveis tanto de RNAs virais como de hospedeiros; (iii) é comparativamente simples, exigindo um processamento mínimo da amostra; e (iv) fornece mais informações do que a sequência do genoma isoladamente, permitindo uma caracterização da diversidade e ecologia viral.
4. Não tenho certeza se as minhas amostras são adequadas para metatranscriptómica. Pode avaliá-las primeiro?
Absolutamente. Oferecemos avaliações de viabilidade gratuitas com base nos seus objetivos de estudo e tipo de amostra. Antes de iniciar o sequenciamento, recomendaremos a melhor plataforma, profundidade e estratégia analítica adaptadas aos seus objetivos.
5. Posso integrar metatranscriptómica com metagenómica ou outros conjuntos de dados ómicos?
Sim, especializamo-nos na integração de multi-ómicas. Quer esteja a combinar com metagenómica, metabolómica ou transcriptómica do hospedeiro, a nossa equipa pode construir um fluxo de trabalho analítico unificado para descobrir insights funcionais e taxonómicos através de conjuntos de dados.
Referências
- Shi M, Neville P, Nicholson J, et al. Metatranscriptómica de Alta Resolução Revela as Dinâmicas Ecológicas dos Vírus de RNA Associados a Mosquitos na Austrália Ocidental. Revista de Virologia, 2017, 91(17): e00680-17.
- Shi M, Zhang Y Z, Holmes E C. Meta-transcriptómica e A Biologia Evolutiva dos Vírus de RNA. Pesquisa de vírus, Desculpe, não posso acessar ou traduzir conteúdos de links externos. Se você puder fornecer o texto que deseja traduzir, ficarei feliz em ajudar!
Estudos de Caso de Sequenciação Metatranscriptómica
Destaque de Publicação do Cliente
Bactérias Oxidantes de Hidrogénio São Abundantes em Solos Desérticos e Fortemente Estimuladas pela Hidratação
Diário: mSistemas
Publicado2020
DOI: 10.1128/mSystems.01131-20
Fundo
Os solos do deserto sustentam comunidades bacterianas diversas, apesar da aridez extrema. Embora a fotossíntese tenha sido tradicionalmente considerada a principal fonte de energia, evidências recentes sugerem que gases traço atmosféricos (por exemplo, H₂) podem apoiar a sobrevivência microbiana. Este estudo investigou o papel das bactérias oxidantes de hidrogênio em quatro desertos globais (Australiano, Namibe, Gobi, Mojave), revelando taxas de oxidação de H₂ sem precedentes estimuladas pela hidratação e sua coexistência com a fotossíntese.
Objetivos do Projeto
- Perfil MetabólicoQuantificar a distribuição/atividade de hidrogenases e fotossistemas.
- Resposta à HidrataçãoAvaliar as alterações na atividade microbiana durante os ciclos húmido-seco.
- Validação Cruzada no DesertoCompare a oxidação de H₂ em desertos polares vs. desertos não polares.
Serviços da CD Genomics
Como parceiro de análise genómica, a CD Genomics possibilitou:
- Metagenómico & Sequenciação Metatranscriptómica
- Plataforma: Illumina NovaSeq (metagenómica shotgun) + Oxford Nanopore (montagem MAG de leitura longa).
- Cobertura: 563M de pares de leitura para solo do deserto australiano; multi-ómicas para séries temporais de hidratação.
- Preparação de Biblioteca: Bibliotecas com índices duplos de solo a uma profundidade de 0–10 cm; depleção de rRNA para transcriptomas.
- Análise Bioinformática
- Montagem e Agrupamento: MetaSPAdes v3.15; MaxBin2 para 39 genomas montados de metagenomas (MAGs).
- Anotação Funcional:
- HydDB para classificação de hidrogenases (grupos 1h, 1l, 2a).
- KEGG/MEROPS para as vias de respiração, fotossíntese e fixação de carbono.
- Análise de Variantes: Chamada de SNP em genes de hidrogenase em diferentes continentes.
- Validação de Atividade
- Cromatografia gasosa (CG) para taxas de consumo de H₂ (Fig. 3).
- Rotulagem isotópica (¹³C-CO₂) para quantificar a fixação de carbono.
Principais Conclusões
- Genes de Hidrogenase Ubíquos
- As sequências de hidrogenases dominaram os metagenomas (45% da comunidade), prevalecendo em Actinobacteriota (39%), Proteobacteria (17%) e Cyanobacteria (3,2%).
- Primeiro relatório de hidrogenases [NiFe] do grupo 2a em cianobactérias do deserto.Nostoc, Tolyopthrix).
- Surto Metabólico Induzido pela Hidratação
- As taxas de oxidação de H₂ aumentaram 950 vezes após a hidratação (Fig. 3c).
- A fotossíntese e a fixação de carbono em condições de escuridão aumentaram 3 vezes e 1,7 vezes, respetivamente.
- Conservação Global dos Desertos
- Genes de hidrogenase confirmados em todos os quatro desertos. A oxidação de H₂ foi simultaneamente ativada com a fotossíntese ao ser molhada, desmentindo as anteriores hipóteses de "modo de energia alternado".
Figuras Referenciadas
FIG 3 Oxidação de H2 por amostras de microcosmos de solo do deserto australiano.
Fig. 2: Mapas de calor mostrando as hidrogenases (grupos 1h/1l/2a) como os genes respiratórios mais abundantes. A expressão persistiu mesmo após a hidratação (144 TPM em solos secos; estável em solos húmidos).
Implicações
- Modelagem EcológicaA oxidação de H₂ é uma fonte de energia importante para os microbiomas do deserto, revendo os modelos de fluxo de carbono/energia em ecossistemas áridos.
- Resiliência ClimáticaBactérias responsivas à hidratação poderiam engenheirar comunidades de solo tolerantes à seca para a restauração de desertos.
- Impacto BiogequímicoO consumo global de H₂ pelos desertos pode influenciar os orçamentos de gases atmosféricos.
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