Sequenciação Metatranscriptómica para Perfilagem Funcional do Microbioma

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

A distribuição da taxonomia de todas as amostras no nível de classificação do Filo.

Mapa de calor da abundância de espécies.

Curva de rarefação das leituras sequenciadas para todas as amostras.

Análise de boxplot baseada em bray Curtis (A), jaccard binário (B), unifrac não ponderado (C) e unifrac ponderado (D).

Análise PCoA baseada em bray Curtis (A), jaccard binário (B), unweighted unifrac (C) e weighted unifrac (D).

Árvore de agrupamento UPGMA baseada em unifrac não ponderado (A) e unifrac ponderado (B).

Boxplot de TPM para cada amostra.

Gráfico de correlação do número de genes.

Resultados estatísticos da anotação GO para CLC_vs_SLC.

Classificação KEGG CLC_vs_SLC.

Estatísticas de base de dados de funções específicas com anotações comuns e únicas.

Classificação de funções CAZy.

1. Quais são os problemas notáveis das amostras de RNA?

A contaminação deve ser rigorosamente excluída durante a amostragem. Em detalhe, os instrumentos e consumíveis relacionados com a amostragem devem ser esterilizados e livres de RNase. As amostras obtidas frescas devem ser imediatamente congeladas, colocando-as em azoto líquido, ou submetendo diretamente as amostras ambientais ou clínicas originais a nós. A quantidade total de RNA recomendada para submissão é de 6 µg ou mais, com uma concentração superior a 50 ng/µl.

2. Que tipo de métodos de controlo de qualidade (QC) você adota para as amostras do cliente?

Faremos QC nas suas amostras de RNA total antes de as sequenciar. Utilizamos o Agilent Bioanalyzer para determinar o Número de Integridade do RNA (RIN). Se o RIN for inferior a 8, as amostras não passarão no QC. O QC da biblioteca também será realizado utilizando o Agilent Bioanalyzer para determinar o tamanho e a pureza da biblioteca. Além disso, antes de carregar as bibliotecas no sequenciador, realizamos a quantificação por qPCR. O custo para isso está incluído no serviço de sequenciação. Os dados brutos passarão no nosso filtro Q30, o que significa que mais de 80% das bases terão uma pontuação de qualidade superior a Q30.

3. Quais são as vantagens da metatranscriptómica?

A metatranscriptómica é a análise genómica de transcriptomas microbianos completos, fornecendo uma fonte de dados particularmente rica sobre a diversidade global de vírus de RNA e a sua história evolutiva. A metatranscriptómica apresenta várias vantagens em relação a métodos tradicionais, como cultura celular, PCR de consenso, e metagenómica abordagens baseadas na purificação de partículas virais.

A metatranscriptómica tem-se mostrado bem-sucedida na caracterização dos viromas de RNA de diversos invertebrados. Especificamente: (i) revela o viroma de RNA completo, com cobertura suficiente para montar genomas virais completos, incluindo aqueles de parasitas co-infectantes; (ii) oferece uma quantificação e avaliação fiáveis tanto de RNAs virais como de hospedeiros; (iii) é comparativamente simples, exigindo um processamento mínimo das amostras; e (iv) fornece mais informações do que a sequência do genoma isoladamente, permitindo uma caracterização da diversidade e ecologia viral.

4. Não tenho certeza se as minhas amostras são adequadas para metatranscriptómica. Pode avaliá-las primeiro?

Absolutamente. Oferecemos avaliações de viabilidade gratuitas com base nos seus objetivos de estudo e tipo de amostra. Antes de iniciar o sequenciamento, recomendaremos a melhor plataforma, profundidade e estratégia analítica adaptadas aos seus objetivos.

5. Posso integrar metatranscriptómica com metagenómica ou outros conjuntos de dados ómicos?

Sim, especializamo-nos na integração de multi-ômicas. Quer esteja a combinar com metagenómica, metabolómica ou transcriptómica do hospedeiro, a nossa equipa pode construir um fluxo de trabalho analítico unificado para descobrir insights funcionais e taxonómicos através de conjuntos de dados.

Referências

1. Shi M, Neville P, Nicholson J, et al. Metatranscriptómica de Alta Resolução Revela as Dinâmicas Ecológicas dos Vírus de RNA Associados a Mosquitos na Austrália Ocidental. Revista de Virologia, 2017, 91(17): e00680-17.
2. Shi M, Zhang Y Z, Holmes E C. Meta-transcriptómica e A Biologia Evolutiva dos Vírus de RNA. Pesquisa de vírus, Desculpe, mas não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, cole-o aqui e terei o prazer de ajudar com a tradução.

Destaque de Publicação do Cliente

Bactérias Oxidantes de Hidrogénio São Abundantes em Solos Desérticos e Fortemente Estimuladas pela Hidratação

Diário: mSistemas

Publicado2020

DOI: 10.1128/mSystems.01131-20

Fundo

Os solos do deserto sustentam comunidades bacterianas diversas, apesar da aridez extrema. Embora a fotossíntese tenha sido tradicionalmente considerada a principal fonte de energia, evidências recentes sugerem que gases traço atmosféricos (por exemplo, H₂) podem apoiar a sobrevivência microbiana. Este estudo investigou o papel das bactérias oxidantes de hidrogénio em quatro desertos globais (Australiano, Namibe, Gobi, Mojave), revelando taxas de oxidação de H₂ sem precedentes estimuladas pela hidratação e pela sua coexistência com a fotossíntese.

Objetivos do Projeto

1. Perfilamento MetabólicoQuantificar a distribuição/atividade de hidrogenases e fotossistemas.
2. Resposta à HidrataçãoAvaliar as alterações na atividade microbiana durante os ciclos húmido-seco.
3. Validação Cruzada no DesertoComparar a oxidação de H₂ em desertos polares vs. não polares.

Serviços da CD Genomics

Como parceiro de análises genómicas, a CD Genomics possibilitou:

1. Metagenómico & Sequenciação Metatranscriptómica
   • Plataforma: Illumina NovaSeq (metagenómica shotgun) + Oxford Nanopore (montagem MAG de leituras longas).
   • Cobertura: 563M de pares de leitura para solo do deserto australiano; multi-ômica para séries temporais de hidratação.
   • Preparação de Biblioteca: Bibliotecas com dupla indexação a partir de solos com profundidade de 0–10 cm; depleção de rRNA para transcriptomas.
2. Análise de Bioinformática
   • Montagem e Agrupamento: MetaSPAdes v3.15; MaxBin2 para 39 genomas montados de metagenomas (MAGs).
   • Anotação Funcional:
     • HydDB para classificação de hidrogenases (grupos 1h, 1l, 2a).
     • KEGG/MEROPS para os caminhos de respiração, fotossíntese e fixação de carbono.
   • Análise de variantes: chamada de SNP em genes de hidrogenase através de continentes.
3. Validação de Atividades
   • Cromatografia gasosa (CG) para taxas de consumo de H₂ (Fig. 3).
   • Rotulagem isotópica (¹³C-CO₂) para quantificar a fixação de carbono.

Principais Conclusões

1. Genes de Hidrogenase Ubíquos
   • As sequências de hidrogenases dominaram os metagenomas (45% da comunidade), prevalecendo em Actinobacteriota (39%), Proteobacteria (17%) e Cyanobacteria (3,2%).
   • Primeiro relatório de hidrogenases [NiFe] do grupo 2a em cianobactérias do desertoNostoc, Tolyopthrix).
2. Surto Metabólico Induzido pela Hidratação
   • As taxas de oxidação de H₂ aumentaram 950 vezes após a hidratação (Fig. 3c).
   • A fotossíntese e a fixação de carbono em condições de escuridão aumentaram 3 vezes e 1,7 vezes, respetivamente.
3. Conservação Global dos Desertos
   • Genes de hidrogenase confirmados em todos os quatro desertos. A oxidação de H₂ foi simultaneamente ativada com a fotossíntese ao ser molhada, desmentindo as anteriores hipóteses de "modo de energia alternado".

Figuras Referenciadas

FIG 3 Oxidação de H2 por amostras de microcosmos de solo do deserto australiano.

Fig. 2: Mapas de calor mostrando as hidrogenases (grupos 1h/1l/2a) como os genes respiratórios mais abundantes. A expressão persistiu mesmo após a hidratação (144 TPM em solos secos; estável em solos húmidos).

Implicações

1. Modelagem EcológicaA oxidação de H₂ é uma fonte de energia importante para os microbiomas do deserto, revendo os modelos de fluxo de carbono/energia em ecossistemas áridos.
2. Resiliência ClimáticaBactérias responsivas à hidratação poderiam engenhar comunidades de solo tolerantes à seca para a restauração de desertos.
3. Impacto BiogequímicoO consumo global de H₂ pelos desertos pode influenciar os orçamentos gasosos atmosféricos.