MeDIP‑Seq / hMeDIP‑Seq (Perfilagem de Metilação e Hidroximetilação de DNA)

A CD Genomics oferece MeDIP-seq para perfilagem de metilação em todo o genoma e hMeDIP-seq para capturar seletivamente 5-hidroximetilcitosina (5hmC), permitindo a análise paralela de múltiplas modificações de citosina.

Introdução ao MeDIP seq e hMeDIP seq

A metilação do DNA refere-se à manutenção pós-replicativa ou adição de novo de um grupo metilo à posição carbono-5 do anel pirimidínico da citosina por metiltransferases de DNA. Em mamíferos, a metilação do DNA ocorre tipicamente em contextos CG (mCG) e não-CG (mCHG ou mCHH, coletivamente referidos como mC). O mCG por si só representa aproximadamente 60–80% de todos os dinucleotídeos CG. Além da 5-metilcitosina (5mC), várias modificações da citosina foram identificadas, incluindo 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formilcitosina e 5-carboxilcitosina. Entre elas, a 5hmC é estruturalmente semelhante à 5mC, mas muito menos abundante, e é gerada através da oxidação da 5mC pela família TET de dioxygenases.

A metilação e a hidroximetilação do DNA são ambas marcas epigenéticas cruciais implicadas na regulação gênica, desenvolvimento embrionário, diferenciação celular e estabilidade do genoma. A análise em todo o genoma tanto de 5mC como de 5hmC fornece uma visão crítica sobre a dinâmica epigenética, particularmente em estudos de desenvolvimento e resposta ao stress.

MeDIP‑seq combina imunoprecipitação com sequenciação de alto rendimento para enriquecer e perfilar 5mC em todo o genoma. Utiliza anticorpos anti-5mC para capturar seletivamente fragmentos de DNA contendo citosinas metiladas (nos contextos mCG e mCH). Estes fragmentos enriquecidos são sequenciados, e a sua distribuição de leituras pode ser utilizada para estimar os níveis relativos de metilação.

Para distinguir e perfilar especificamente 5hmC, a CD Genomics também oferece hMeDIP‑seq, que utiliza anticorpos específicos para 5hmC para enriquecer fragmentos de DNA hidroximetilados. Esta abordagem complementar permite que os investigadores perfilam separadamente as modificações 5mC e 5hmC em paralelo, melhorando a resolução do mapeamento epigenético em diversos tipos de amostras. Tanto o MeDIP‑seq como o hMeDIP‑seq são métodos não destrutivos e sem conversão que não dependem de tratamento com bisulfito ou polimerases tolerantes ao uracilo, e são compatíveis com amostras de baixo input.

Vantagens do MeDIP-Seq / hMeDIP-Seq

• Pode direcionar mC, mCG ou hmC.
• Genoma completo ou quaisquer regiões de interesse
• Quase imparcial e hipótese
• Descoberta de biomarcadores epigenéticos
• Resolução de nucleótido único e eficiência de custos
• Baixa necessidade de DNA de entrada

Aplicações de MeDIP-Seq / hMeDIP-Seq

• Heterogeneidade Epigenética
• Ambiente e Epigenética
• Regulação da Expressão Genética
• Pesquisa de Doenças
• Imprinting Genético
• Desenvolvimento Embrionário
• Deteção de regiões enriquecidas em metilação de DNA em amostras de doença e inferência de conjuntos de genes candidatos cuja expressão está suprimida nas amostras.
• Monitorizar os padrões dinâmicos de metilação do DNA em diferentes estágios da ocorrência e desenvolvimento da doença, particularmente em locais de lesão, para identificar marcadores epigenéticos que ajudem a definir a extensão da progressão da doença.
• Análise comparativa das diferenças na distribuição de sinal e localização das regiões de metilação do DNA entre amostras doentes e normais, identificação de regiões de metilação do DNA específicas da doença e observação dos genes circundantes a estas regiões para restringir a lista de genes candidatos relacionados com a doença.
• Mapeamento das paisagens de hidroximetilação (5hmC) em tecidos, diferenciação celular ou modelos de resposta ao stress utilizando hMeDIP-seq.

Fluxo de Trabalho MeDIP-Seq / hMeDIP-Seq

O fluxo de trabalho geral para a sequenciação MeDIP está descrito abaixo. Resumidamente, o DNA extraído é fragmentado, desnaturado, ligado a um adaptador e capturado usando o anticorpo dirigido contra 5-metilcitosina (para MeDIP-seq) ou 5-hidroximetilcitosina (para hMeDIP-seq), seguido pela preparação da biblioteca e sequenciação em plataformas Illumina.

Especificação de Serviço

	Requisitos de Amostra DNA genómico ≥ 2 μg, Quantidade Mínima: 1 μg, Concentração ≥ 100 ng/µl OD 260/280=1,8~2,0 Todo o DNA deve ser tratado com RNase e não deve apresentar degradação ou contaminação. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciamento Preparação de bibliotecas MeDIP/hMeDIP Illumina HiSeq4000, PE150 50M leituras ou 10 G de dados por amostra Mais de 80% das bases com uma pontuação de qualidade ≥Q30
	Análise de Dados Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Alinhamento contra o genoma de referência Alinhamento contra o genoma de referência Distribuição da região do genoma completo Estatísticas de distribuição de picos Triagem de genes associados ao pico Anotação funcional com análise GO/KEGG Análise do nível de expressão diferencial de genes associados a picos Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em MeDIP-Seq / hMeDIP-Seq para a sua escrita (personalização)

Com capacidade profissional em bioinformática, a CD Genomics oferece MeDIP-Seq de alta qualidade como um serviço epigenético abrangente e de ponta a ponta para identificar regiões diferencialmente metiladas e, em última análise, ajudar a acelerar a investigação epigenética. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contacte-nos.

Referência:

1. Taiwo O, Wilson G A, Morris T, et al.Análise do metiloma utilizando MeDIP-seq com baixas concentrações de ADN. Protocolos da Natureza, 2012, 7(4): 617.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

1. Comparado com outros métodos, quais são as vantagens da sequenciação MeDIP?

Atualmente, a abordagem baseada em sequenciação para análise do metiloma pode ser classificada em métodos baseados em conversão com bisulfito e métodos baseados em enriquecimento. Os métodos baseados em conversão com bisulfito incluem genoma completo ou direcionado sequenciação por bisulfito ou sequenciação de bisulfito com representação reduzida (RRBS)Embora os métodos baseados na conversão de bisulfito sejam considerados o padrão ouro da análise de metilação de DNA com resolução de base única, eles não conseguem distinguir entre mC e hmC. Além disso, sequenciação de bisulfito do genoma completo é caro para aplicação em grandes tamanhos de amostra e por grupos de pesquisa menores. E o RRBS só pode fornecer cobertura genómica limitada (5-10%) e está centrado em ilhas CpG e regiões promotoras.

Além da sequenciação MeDIP, as tecnologias baseadas em enriquecimento também incluem MBD-seq, que utiliza as proteínas de ligação a metilo MBD2 e MDB3L1, e methylCap-seq que utiliza o domínio de ligação a metilo do MECP2 para captura de metilo. No entanto, MBD-seq e methylCap-seq estão restritos à análise de mCG e os protocolos de genoma completo frequentemente requerem altas concentrações de DNA genómico (mais de 1.000 ng). Portanto, MeDIP é um método versátil, preciso e dispendioso, com uma baixa exigência de DNA de entrada e é aplicável a uma ampla gama de amostras e estudos.

2. Quais são os requisitos para amostras de sequenciação MeDIP?

As amostras de sequenciação MeDIP requerem um genoma de referência ou sequências para alinhamento, e os resultados montados afetam diretamente a precisão da análise de dados. O genoma de referência de espécies estreitamente relacionadas ou resultados montados do transcriptoma também podem ser utilizados, apesar da perda de informações parciais de metilação.

3. Quais fatores podem afetar os resultados do MeDIP-seq?

Cada processo envolvido no MeDIP-seq pode afetar os resultados, especialmente a imunoprecipitação e a PCR. A imunoprecipitação é o processo de enriquecer regiões metiladas, e as condições da reação podem influenciar os resultados do enriquecimento. Se o DNA reciclado for insuficiente, a PCR é utilizada para aumentar a quantidade, o que pode enviesar os resultados. Além disso, a contaminação deve ser evitada ao longo de todo o processo.

Alterações epigenéticas em ratos TRAMP: perfilagem de metilação de DNA do epigenoma usando MeDIP-seq

Revista: Células & Biociência
Publicado: 12 de janeiro de 2018

Resumo

Os autores caracterizaram o metiloma do modelo de cancro da próstata em rato (TRAMP) e analisaram a interacção entre os genes alvo e a via funcional relacionada. Ao utilizar sequenciação MeDIP, analisaram Metilação do DNA perfis e realizou análises informáticas relevantes, que poderiam fornecer estratégias para abordagens de prevenção e tratamento do câncer da próstata.

Materiais e Métodos

Resultados

1. Comparação dos resultados de MeDIP-seq

No total, 2147 genes entre os animais TRAMP e de controlo mostraram uma alteração significativa nos picos de metilação. Comparado com o controlo, observou-se um aumento significativo na metilação de 1042 genes e uma diminuição significativa na metilação de 1105 genes nos TRAMP. Quatro genes de interesse, DYNC1I1, SLC1A4, XRCC6BP1 e TTR, foram analisados pelo IGV. Os camundongos TRAMP mostraram um aumento na razão de metilação de DYNC1I1 e SLC1A4, e uma diminuição na razão de metilação de TTR e XRCC6BP1, o que estava de acordo com os resultados do MeDIP-seq.

Figura 1. visualização do visualizador de genómica integrativa da distribuição das leituras alinhadas em relação ao genoma de referência para quatro genes-alvo, DYNC1I1, SLC1A4, XRCC6BP1 e TTR.

2. Validação de expressão génica selecionada por qPCR

Os níveis de expressão de CRYZ, DYNC1I1, HNMT, SLC1A4 e TTR foram medidos tanto no grupo TRAMP como no grupo de tipo selvagem (Figura 2). Entre eles, a expressão de TTR aumentou 9,05 vezes em relação ao WT. E os níveis de expressão de TTR foram significativamente mais elevados no tecido do câncer da próstata do que no tecido normal e na hiperplasia benigna da próstata. Além disso, descobriram uma diminuição da metilação na região do promotor de TTR, mas um aumento na expressão do gene. Em contraste, a metilação do DNA no corpo do gene ou a jusante pode ou não seguir uma relação recíproca.

Figura 2. Comparação da expressão de miRNA de CRYZ, DYNC1I1, HNMT, SLC1A4 e TTR entre amostras de próstata de camundongos do tipo selvagem e TRAMP.

3. Via canónica, doenças e funções e análises de rede.

Os 2147 genes com alterações significativas na metilação foram analisados. As redes relacionadas com o câncer representaram a maioria (Tabela 2), o que sugere que a diferença entre o TRAMP e o controlo reside no desenvolvimento de órgãos e no desenvolvimento do câncer. As doenças mais associadas, câncer, doenças gastrointestinais, anomalias orgânicas, doenças do sistema reprodutivo e doenças dermatológicas, foram classificadas entre as cinco principais (Figura 3).

Tabela 1. Dez principais vias canónicas alteradas.

Tabela 2. Principais redes analisadas.

Figura 3. As cinco principais categorias de doenças associadas (a) e os cinco principais subtipos de cancro (b) analisados.

Discussão

A análise da via canónica forneceria informações para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos. Como mostrado na Figura 4, os genes com metilação significativa na via canónica principal foram a via de sinalização da dor neuropática, o que é consistente com a descoberta anterior de que a malignidade mais comum no TRAMP é de origem neuroendócrina. A Tabela 3 lista os genes envolvidos nesta via que mostraram metilação modificada. O CREB foi encontrado estar intimamente relacionado com a proliferação celular, diferenciação e respostas adaptativas no sistema neuronal, e a metilação do gene CREB1 foi reduzida em 2,274 no TRAMP. Além disso, o CREB também foi encontrado a regular outras vias de carcinogénese. Todos esses dados indicam que o CREB está altamente ligado à terapia do câncer e pode ser uma nova estratégia para a prevenção e terapia do câncer da próstata.

Figura 4. Genes mapeados para a via de sinalização canónica da dor neuropática.

Tabela 3. Genes de metilação alterada mapeados para a via de sinalização da dor neuropática.

Referência:

1. Li W, Huang Y, Sargsyan D, et al.Alterações epigenéticas em ratos TRAMP: perfilagem de metilação de DNA do epigenoma utilizando MeDIP-seq. Células e biociências, 2018, 8(1): 3.