Diretrizes para Submissão de Amostras
Por que escolher os nossos serviços de Ribo-seq
Construído para cientistas. A CD Genomics oferece Ribo-seq com resolução a nível de códon—combinando métodos otimizados de laboratório e um pipeline de análise de ribo-seq transparente para resultados reproduzíveis.
- QC ciente da tradução: periodicidade de 3 nt, desvios do sítio P, metagene de início/paragem, concordância de replicados.
- Entrega flexível: De ponta a ponta ou apenas análise a partir de RPFs purificados/FASTQ brutos.
- Análise profunda: TE e tradução diferencial, uORF/sORF, paragem, uso de códon, GO/KEGG.
- Design TE-pronto: RNA-seq opcional combinado para uma eficiência de tradução robusta.
- Fluxo de trabalho de laboratório optimizado: Inibidor → RNase → depleção de rRNA → PAGE.
- Entradas amplas: Células, tecidos, bactérias ou RPFs; espécies não-modelo por revisão.
- Saídas prontas para publicação: Figuras limpas (PNG/SVG), tabelas (CSV/TSV), relatório conciso.
- Rastreável e seguro: registos de comandos versionados, metadados completos, manuseio orientado por SOP.
- Apoio especializado: Cientista consulta sobre design, portas de controlo de qualidade e opções de pipeline de análise de ribo-seq.
Introdução à Tecnologia — O que a Profilagem de Ribossomas (Ribo-seq) Mede
A Profilagem de Ribossomas (Ribo-seq) captura fragmentos protegidos por ribossomas para quantificar a tradução ativa. O nosso serviço de Ribo-seq combina execução em laboratório húmido com peritos em Ribo-seq. análise de dados num pipeline de análise de ribo-seq validado.
Os ribossomas são estabilizados no mRNA. O RNA não protegido é digerido pela RNase. Fragmentos de ~28–30 nt (RPFs) são purificados, convertidos em bibliotecas e sequenciados. Impressões resolvidas por posição revelam a iniciação, dinâmica de elongação, pausas e comportamento de terminação.
Por que o Ribo-seq é importante
- Distingue as alterações transcricionais do controlo translacional utilizando a eficiência de tradução (ET).
- Mapeia locais de iniciação e uORFs/sORFs com chamada de P-site consciente do quadro.
- Deteta a paragem do ribossoma ou sinais de deslocamento de quadro ao longo das regiões codificantes.
- Vincula descobertas a vias através de enriquecimento GO/KEGG.
Fluxo de trabalho principal (laboratório → análise)
1. Estabilização da tradução → Digestão com RNase → Depleção de rRNA → Seleção de tamanho por PAGE.
2. Preparação da biblioteca → sequenciação de leituras curtas.
3. Análise de Ribo-seq: alinhamento, atribuição do P-site, QC de periodicidade de 3-nt, TE e tradução diferencial, uORF/sORF, paragem, uso de códons, enriquecimento.
Pipeline de Análise de Ribo-seq
O nosso pipeline de análise de ribo-seq combina um fluxo de trabalho de laboratório padrão com etapas de análise de ribo-seq transparentes. Cada fase é rastreável e sujeita a controlo de qualidade.
Fluxo de trabalho em laboratório húmido
1. Estabilizar a tradução — congelar ribossomas no mRNA.
2. Digestão com RNase — remover RNA não protegido; reter RPFs (~28–30 nt).
3. Depleção de rRNA e PAGE — reduzir a contaminação por rRNA; selecionar alvos por tamanho.
4. Construção da biblioteca — ligação de adaptadores, transcrição reversa, PCR.
5. Sequenciação — plataformas de leitura curta; profundidade ajustada aos objetivos.
Processamento de dados (ribo-seq) análise de dados)
1. QC de leitura bruta — filtragem de adaptadores/qualidade; distribuição de comprimento.
2. Alinhamento — mapeamento do genoma/transcriptoma; remover leituras de rRNA/tRNA.
3. Atribuição do sítio P — deslocamentos conscientes do quadro para a posicionamento de códons.
4. Periodicidade de 3 nt — perfis de metagene de início/paragem verificam a tradução.
5. Quantificação — contagens de genes/ORF/uORF; normalização.
6. Comparações — TE com RNA-seq emparelhado; tradução diferencial/TE.
7. Módulos avançados — uORF/sORF, mapas de paragem, uso de códon, GO/KEGG.
Estratégia de Pesquisa Ribo-seq
Menu de Análise — Escolher e Estender
Selecione os módulos de que precisa; as saídas integram-se com o pacote acima.
Análises de Integração de Ribo-seq e Multi-ópticas
Ribo Quantitativo
- Contagens de genes/ORF, normalização, tradução diferencial.
- Replicar a correlação e a revisão de outliers.
Nível de sequência
- Metagene do P-site; distribuição de quadros de 3 nt.
- Descoberta de uORF/sORF com coordenadas.
Cross-ómica (com RNA-seq)
- Estimativa da eficiência de tradução (ET) e ET diferencial.
- Conjuntos de mRNA–RPF concordantes/discordantes.
Interpretação avançada
- Mapas de paragem de ribossomas; padrões de utilização de códon.
- Enriquecimento GO/KEGG para conectar a biologia.
Para entregáveis, veja O Que Você Receberá.
Qualidade e Desenho do Estudo
Plano para Ribo-seq reprodutível com critérios de aceitação claros e total rastreabilidade.
Desenho experimental
- Defina contrastes; inclua ≥3 réplicas biológicas por grupo sempre que possível.
- Adicionar RNA-seq correspondido quando TE é um endpoint primário.
Critérios de aceitação (QC ciente da tradução)
- Forte periodicidade de 3 nt e offsets corretos no sítio P.
- Distribuição de comprimento de RPF esperada e taxas de mapeamento robustas.
- Frações de rRNA/tRNA residuais baixas.
- Concordância de alta replicação; revisão formal de outliers.
Rastreabilidade e auditoria
- O registo de execução documenta instrumentos, lotes de equipamentos e parâmetros chave.
- Registos de comandos versionados para cada etapa de análise; metadados retidos com as saídas.
Controlo de profundidade e risco
- Aumentar a profundidade para uORF/sORF ou paragem em escala fina.
- Se a periodicidade for fraca, refine os deslocamentos e reavalie os quadros.
- rRNA elevado: ajustar os SOPs de depleção e seleção de tamanho.
Consulte-nos para espécies não-modelo ou designs de baixo custo.
O Que Você Receberá
Um pacote completo, pronto para publicação, concebido para interpretação rápida.
Ficheiros de dados
- FASTQ; BAM/índices sob solicitação.
- Contar tabelas (genes/ORFs/uORFs/sORFs, CSV/TSV).
- Metadados: configurações do instrumento, notas de execução, manifesto de amostras.
Pacote de QC
- Qualidade de leitura, mapeamento, resíduos de rRNA/tRNA, modos de comprimento de RPF.
- Gráficos de metagene do P-site e periodicidade de 3 nt.
- Replicar o mapa de calor de correlação e as bandeiras de outliers.
Análises entregues
- TE e TE diferencial; tradução diferencial por gene/ORF.
- descoberta de uORF/sORF, pontos de paragem, perfis de utilização de códon.
- Enriquecimento funcional: termos e vias GO/KEGG.
Relatar e apoiar
- PDF conciso com figuras e notas de interpretação.
- Figuras editáveis (PNG/SVG) e tabelas (CSV/TSV).
Add-ons recomendados
- mRNA/long-RNA-seq emparelhado para TE robusto.
- Genomas/anotações personalizados para organismos não-modelo.
- Biostatística avançada e aprimoramento de figuras.
Requisitos de Amostra
| Tipo de Amostra | Entrada Mínima | Preferências / Notas |
|---|---|---|
| Células | ≥ 4 × 10^7 células | Baixo-input por revisão: ≥ 1 × 10^7 |
| Tecido (animal/vegetal) | ≥ 400 mg | ~3 g preferido; baixa entrada por revisão: ≥ 50 mg |
| Bactérias | ≥ 4 × 10^7 células | — |
| RPFs purificados | ≥ 200 ng/µL, ≥ 10 µL no total | Fragmentos protegidos por ribossomas purificados |
Aplicações e Casos de Uso — Resultados que Pode Esperar
Utilize o Ribo-seq quando os níveis de RNA não forem suficientes. O nosso serviço de ribo-seq e o pipeline de análise de ribo-seq transformam pegadas em decisões—rápidas, auditáveis e prontas para ação.
Mecanismo de ação do fármaco
- Identificar respostas ao tratamento a nível de tradução utilizando a análise de dados de ribo-seq.
- Leituras: deslocamentos de TE, alterações de iniciação, pontos de pausa, impacto no caminho.
Validação de alvos e biomarcadores
- Vincule as alterações do TE à produção de proteínas para priorização.
- Leituras: tabelas TE classificadas, evidências de uORF/sORF, resumos GO/KEGG.
Avaliação de resistência e de alvos não específicos
- Detetar a reconfiguração da tradução sob stress ou dosagem crónica.
- Leituras: tradução diferencial, mapas de estagnação, padrões de uso de códons.
Pesquisa imunológica
- Quantificar como as modificações de RNA alteram o TE regulador e a expansão clonal.
- Leituras: metagene do P-site de início/paragem, painéis de TE focados em reguladores.
Virologia
- Medir o frameshifting e a pausa em poliproteínas virais com resolução de códon.
- Leituras: ocupação a nível de ORF, cobertura do locus de frameshift, diferenciais de TE.
Planta e agricultura
- Resolver a regulação mediada por uORF sob stress e descobrir marcadores robustos.
- Leituras: listas de chamadas de uORF, contrastes de TE entre tratamentos ou genótipos.
Distribuição da qualidade de sequenciação
Distribuição A/T/G/C
Análise de Correlação Entre Amostras
Resultados Estatísticos da Anotação GO
Classificação KEGG
Análise do P-site
Eficiência de Tradução Diferencial (TE) - Distribuição de Genes
Respostas Rápidas para Investigadores
1. O que mede o Ribo-seq em comparação com o RNA-seq?
A Profilagem de Ribossomas (Ribo-seq) sequencia fragmentos protegidos por ribossomas de ~28–30 nt para quantificar a tradução ativa e a eficiência de tradução (TE). O RNA-seq mede a abundância de transcritos; utiliza-se ambos para separar a transcrição da tradução.
2. O que é um ORF e o que pode o Ribo-seq detetar?
Uma estrutura de leitura aberta (ORF) vai de um códon de início (geralmente AUG) a um códon de paragem (UAA/UAG/UGA). O Ribo-seq pode revelar ORFs em mRNA e detectar a tradução a partir de loci de lncRNA ou circRNA (incluindo uORFs/sORFs).
3. Qual é o protocolo para o perfilamento de ribossomas?
Estabilizar ribossomas no mRNA → lisar e aplicar RNase para remover RNA não protegido → enriquecer RPFs (por exemplo, gradiente de sacarose ou PAGE) → construir bibliotecas e sequenciar → executar o pipeline de análise de ribo-seq (alinhamento, atribuição do P-site, QC de periodicidade de 3-nt, TE/tradução diferencial, uORF/sORF, vias).
4. O que vou receber do serviço de ribo-seq?
FASTQ (BAM sob pedido), QC (periodicidade de 3-nt, metagene do P-site, mapeamento), tabelas/figuras de análise (TE, tradução diferencial, uORF/sORF, paragem, GO/KEGG) e um relatório conciso.
5. Preciso de RNA-seq pareado para TE?
Recomendado. Correspondido. RNA-seq permite uma estimativa robusta de TE e clarifica se as alterações são transcricionais ou traducionais.
6. O que prova a qualidade da biblioteca na análise de ribo-seq?
Clara periodicidade de 3 nt, correção dos desvios do sítio P, distribuição de comprimento de RPF esperada, boas taxas de mapeamento e forte correlação entre réplicas.
7. Quais são as principais limitações do Ribo-seq?
O rRNA residual pode reduzir as leituras utilizáveis; as pegadas são curtas, complicando a chamada de ORF; o TE infere a produção de proteínas em vez de medi-la diretamente; os protocolos típicos requerem uma quantidade substancial de material de entrada.
8. Quais entradas e espécies são suportadas?
Células, tecidos, bactérias ou RPFs purificados. Humano/morcego/rato por defeito; outros sujeitos a revisão de viabilidade. Consulte os Requisitos de Amostra para entradas mínimas.
9. Pode executar apenas análises ou pipelines personalizados?
Sim. Aceitamos RPFs purificados ou dados brutos e executamos um pipeline de análise de ribo-seq transparente e modular adaptado ao seu estudo.
Destaque de Publicação do Cliente
Ribo-seq Revela Alterações na Eficiência de Tradução Sob Disrupção de Pol III/tRNA
Diário: PLOS Biologia (2024).
AutoresYasir Malik; Yavuz Kulaberoglu; Shajahan Anver; et al.
1) Contexto
Os tRNAs são fundamentais para a decodificação do mRNA durante a tradução. Os autores questionaram se a redução parcial da RNA polimerase III (Pol III)—que produz tRNAs—reconfigura a tradução e a saúde do organismo em diversas espécies (vermes, moscas, ratos). Eles relatam uma interrupção conservada dos tRNAs e uma melhoria na resiliência proteostática, com benefícios para a saúde na velhice e para a longevidade.
2) Métodos
- Design: Reduzir a função da Pol III geneticamente ou por RNAi em organismos modelo; avaliar a tradução e a resiliência ao stress.
- Ribo-seq & RNA-seq (Drosophila): Preparação de amostras e sequenciação realizadas pela CD Genomics; digestão com RNase I; kit de biblioteca de pequenos RNAs NEBNext; Illumina HiSeq X10. A análise utilizou FastQC, Cutadapt, RiboToolkit, Salmon e DESeq2 para calcular a tradução diferencial e a eficiência de tradução (TE). Dados depositados no GEO (GSE232724).
3) Resultados
- Cobertura em todo o genoma: Impressões de Ribo-seq mapeadas a mais de 19.000 ORFs em moscas, apesar da esperada contaminação de rRNA típica de Drosophila.
- Remodelação do TE: A integração do Ribo-seq com RNA-seq identificou >400 mRNAs com TE alterado em mutantes de Pol III em comparação com o tipo selvagem a 10% de FDR.
- Ligação mecanicista: Modelagem previu alterações específicas de decodificação de códons a partir de pools de tRNA deslocados; ensaios experimentais confirmaram alterações na tradução e aumentaram a resiliência proteostática entre espécies.
4) Conclusões
O Ribo-seq revelou uma reprogramação a nível sistémico da tradução quando a biogénese do tRNA é perturbada. A combinação do Ribo-seq com RNA-seq permitiu leituras baseadas em TE que conectaram a decodificação molecular à resiliência e longevidade a nível do organismo, ilustrando como o Perfilamento de Ribossomas apoia estudos sobre o mecanismo de ação.
Mudanças previstas e observadas na tradução após inibição parcial da Pol III em vermes, moscas e ratos.
Aqui estão algumas publicações que foram publicadas com sucesso utilizando os nossos serviços ou outros serviços relacionados:
A interrupção da biogénese do tRNA aumenta a resiliência proteostática, melhora a saúde na vida posterior e promove a longevidade.
Revista: Plos Biologia
Ano: 2024
Os vírus tumorais de DNA circular produzem RNAs circulares.
Revista: Anais da Academia Nacional de Ciências
Ano: 2018
A imunização repetida com adjuvante lipossomal contendo ATRA transdiferencia as células Th17 para um fenótipo semelhante ao Tr1.
Revista: Revista de Autoimunidade
Ano: 2024
O papel da variante de histona H2A.Z.1 na memória, transcrição e splicing alternativo é mediado pela modificação de lisina.
Revista: Neuropsicofarmacologia
Ano: 2024
A perda de FAK reduz a fosforilação de ERK induzida por BRAFV600E para promover a stemness intestinal e a formação de tumores cecais.
Revista: Elife
Ano: 2023
Identificação de RNAs circulares que regulam a proliferação de cardiomiócitos em corações de porcos neonatais
Jornal: JCI insight
Ano: 2024
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