Triagem de Anticorpos por Sequenciação (Triagem de Biblioteca de Exibição de Fagos)

A CD Genomics está comprometida em oferecer soluções avançadas. sequenciação de próxima geração (NGS) estratégia para ajudar os investigadores a selecionar as bibliotecas de exibição de fágios de forma de alto rendimento, permitindo preservar a diversidade das bibliotecas de anticorpos e selecionar rapidamente a pluralidade de anticorpos relacionados, bem como fágios raros numa grande população que podem ser recuperados e testados quanto à sua atividade.

O que é uma Biblioteca de Exibição de Fagos?

Uma biblioteca de exibição de fagos é uma ferramenta utilizada em biologia molecular que consiste numa vasta coleção de bacteriófagos, que são vírus que infectam especificamente bactérias. Cada fago na biblioteca é projetado para apresentar um peptídeo ou fragmento de proteína único na sua superfície. Ao exibir estes peptídeos ou proteínas, os investigadores podem testar sistematicamente quais deles se ligam a uma molécula-alvo específica, como uma proteína ou antígeno de interesse. Este processo permite que os cientistas identifiquem e isolem aqueles com alta afinidade pelo alvo, tornando-se uma técnica poderosa para descobrir novos anticorpos, desenvolver diagnósticos e explorar interações proteicas.

Introdução ao Rastreio de Bibliotecas de Exibição de Fagos

A exibição de fágios é uma técnica laboratorial poderosa e amplamente utilizada para identificar peptídeos que se ligam a alvos específicos. Este método baseia-se fundamentalmente numa biblioteca composta por milhões, ou até bilhões, de partículas de fágios, cada uma expressando uma variedade diversificada de peptídeos exógenos fundidos a proteínas da cápsula do fágio. Para isolar ligadores de alta afinidade e alta especificidade, são realizadas várias rondas de seleção, também conhecidas como biopanning. Este processo reduz a biblioteca altamente diversificada a alguns compostos principais e requer amplificação para enriquecer clones de fágios que apresentam peptídeos de ligação ao alvo. A exibição de fágios é particularmente crucial na descoberta e engenharia de anticorpos, uma vez que fragmentos de anticorpos (como scFv ou Fab) podem ser facilmente expressos e exibidos nas superfícies dos fágios.

O cerne da exibição de fágios é a análise das sequências peptídicas presentes na biblioteca. Tradicional Sequenciação de Sanger necessita da isolação de ADN de clones de fago individuais, uma metodologia laboriosa e em pequena escala que depende de amplificações repetidas. Esta abordagem é limitada pela sua incapacidade de processar mais de cem clones de biblioteca e pode introduzir preconceitos imprevisíveis em relação a certas sequências de anticorpos nas bactérias.

A sequenciação profunda da Illumina oferece vantagens substanciais para a análise de ecrãs de exibição de fago, especialmente para coleções de sequências abrangentes. Permite menos rondas de seleção e pode potencialmente identificar ligantes com uma única ronda, mitigando problemas de preconceitos desnecessários e colapso da diversidade introduzidos durante a amplificação. Assim, facilita a descoberta de ligandos que podem ter sido anteriormente negligenciados ou sub-representados em estudos de exibição de fago. Além disso, as plataformas de NGS podem caracterizar até 10^6-10^8 sequências em uma única execução, resultando numa cobertura de conteúdo mais representativa e significativa. A estratégia para sequenciar bibliotecas de fago usando NGS é ilustrada na Figura 1.

Figura 1. Fluxo de trabalho de triagem de anticorpos a partir de uma biblioteca de exibição de fago por NGS.

Os nossos especialistas podem orientá-lo na conceção dos primers de PCR que contêm sequências que delimitam a região variável, adaptadores e códigos de barras para o enriquecimento de candidatos específicos da forma mais eficaz. Além disso, desenvolvemos um pipeline de análise bioinformática que é bem adequado para a análise de sequências de anticorpos, a fim de melhorar a descoberta.

Vantagens do Nosso Serviço de Triagem de Biblioteca de Exposição a Fagos

• Precisão considerávelA sequenciação ultra-profunda fornece uma alta cobertura e dados de alta qualidade.
• Seleção rápidaA ronda de seleção pode ser reduzida a uma única ronda.
• Caracterização da afinidade e estabilidade de anticorposDados extensivos proporcionam uma compreensão mais profunda.
• Custo-efetivoVários amostras complexas podem ser testadas em paralelo, permitindo uma redução do custo por amostra.
• Apoio abrangenteTemos uma equipa composta por especialistas na área de anticorpos e NGS.

Aplicações da Triagem de Bibliotecas de Exibição de Fagos

• Desenvolvimento de Reagentes Diagnósticos: Identificação de sequências scFv para o desenvolvimento de ensaios diagnósticos sensíveis e específicos.
• Desenvolvimento de Produtos de Terapia com Células Imunes: Construção de vetores CAR-T e CAR-NK para imunoterapia direcionada em doenças como o câncer.
• Tratamento de Doenças: Utilização de scFvs no tratamento de cânceres, doenças autoimunes e degeneração macular relacionada com a idade.

Fluxo de Trabalho de Triagem de Bibliotecas de Exibição de Fagos

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Aceitamos DNA de vetores de fagemid mistos, fagos purificados e também amplicons contendo domínios pesados e leves variáveis de um anticorpo. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciação Illumina HiSeq 50 bp ou 100 bp de extremidade única
	Análise Bioinformática Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Verificação da qualidade da sequência Corte de sequências de baixa qualidade Montagem de sequências Alinhamento de sequências Classificação de variantes de anticorpos Predição da afinidade de anticorpos Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise exibidos são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Triagem de Bibliotecas de Exibição de Fagos para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece serviços abrangentes de Sequenciação de Triagem de Anticorpos (Triagem de Bibliotecas de Exposição a Fagos) projetados para apoiar a descoberta e caracterização de anticorpos específicos. As nossas plataformas avançadas permitem a construção eficiente de bibliotecas de exposição a fagos e a subsequente sequenciação em alta capacidade para identificar e validar candidatos a anticorpos. Oferecemos soluções de ponta a ponta, incluindo construção de bibliotecas de fagos, triagem de anticorpos e análise de sequências. Com as nossas tecnologias de última geração, garantimos a identificação precisa e rápida de sequências de anticorpos, ajudando a otimizar os seus processos de investigação e desenvolvimento. Para quaisquer necessidades específicas ou mais informações, a nossa equipa está pronta para ajudar.

Os resultados parciais estão apresentados abaixo:

1. Quais são as diferenças entre a preparação de anticorpos de cadeia única utilizando bibliotecas de exibição de fagos e os métodos tradicionais de preparação de anticorpos?

Ao contrastar as metodologias de triagem de bibliotecas de exibição de fagos para fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) com a técnica tradicional de hibridoma para a produção de anticorpos, várias distinções chave tornam-se evidentes.

(1) Triagem de Biblioteca de Exibição de Fagos:

Vantagens:

• Eficiência na Imitação de Respostas Imunes: A técnica de exibição de fagos pode simular o processo de produção de anticorpos do sistema imunitário animal, oferecendo vários benefícios únicos que são difíceis de igualar à tecnologia de hibridoma. Notavelmente, a exibição de fagos não requer imunização. Em teoria, um tamanho de biblioteca que varia de 10^8 a 10^10 pode abranger toda a gama de anticorpos possíveis.
• Triagem Direta e Expressão Rápida: Anticorpos específicos podem ser diretamente triados a partir de bibliotecas de anticorpos de animais não imunes utilizando antígenos. Os clones positivos identificados podem então ser recombinados em vetores de expressão de plasmídeos, permitindo que moléculas de anticorpos funcionais sejam expressas diretamente em Escherichia coli ou células eucarióticas. O processo é relativamente rápido, normalmente levando de 16 a 20 semanas para construir e triagem uma biblioteca de anticorpos natural.

Desvantagens:

• Considerações de Afinidade: A afinidade de anticorpos scFv obtidos através de display de fago é frequentemente inferior ou comparável à de anticorpos de comprimento total derivados de técnicas tradicionais de hibridoma. No entanto, esta desvantagem pode ser mitigada se não impedir o reconhecimento de amostras endógenas ou a preservação das estruturas secundárias e terciárias.

(2) Preparação de Anticorpos Baseada em Hibridoma Tradicional:

Vantagens:

• Maturação de Afinidade e Estabilidade: Após múltiplas imunizações, os animais geram anticorpos de afinidade madura. Os linfócitos B destes animais são então fundidos e submetidos a triagens subclonais repetidas para obter linhas celulares de hibridoma que podem secretar anticorpos específicos de forma estável. Este método produz anticorpos naturais de comprimento total com maior afinidade em comparação com os anticorpos scFv das bibliotecas de exibição de fago.
• Aplicabilidade Ampla e Consistência: Os anticorpos resultantes das técnicas de hibridoma são amplamente aplicáveis a diferentes tipos de experimentos e apresentam uma variação mínima entre lotes.

Desvantagens:

• Prazo Alargado: A duração do processo é substancialmente mais longa. Desde a preparação do antigénio até à aquisição de anticorpos de cadeia única, são necessários pelo menos cinco meses.

2. Por que há reatividade cruzada entre o sobrenadante de fago de clones positivos e a deteção por ELISA com etiqueta?

O título do fago no sobrenadante de clones positivos é tipicamente muito elevado, como evidenciado por testes positivos anteriores. Mesmo quando diluído 10 ou 100 vezes, as leituras de OD (densidade óptica) ainda podem atingir cerca de 2.0. Isso sugere que uma pequena quantidade de adsorção não específica é bastante normal.

Durante o processo de biopanning, os fágios que se ligam ao alvo são selecionados, mas apenas alguns clones são identificados como positivos após a triagem por ELISA. O fenómeno da reatividade cruzada no teste ELISA pode ser atribuído a vários fatores. Mais notavelmente, ocorre dentro do equilíbrio preciso das concentrações de antígeno e anticorpo. Para o ELISA indireto, especialmente, tanto o antígeno quanto o anticorpo precisam estar em concentrações adequadas para minimizar a ligação não específica. Concentrações elevadas de qualquer um dos componentes podem agravar as interações não específicas, levando ao que parece ser reatividade cruzada.

Em resumo, o elevado título de fago, juntamente com os equilíbrios subótimos de concentração de antígeno-anticorpo, contribuem para a adsorção não específica e a reatividade cruzada observada na deteção por ELISA de etiquetas.

Seleção e Caracterização de Anticorpos Monoclonais Direcionados ao YKL-40 a partir de Bibliotecas de Exibição de Fagos Fab Sintéticos Humanos

Revista: Engenharia Biomédica da Natureza

Fator de impacto: 29,2

Publicado: 09 de Outubro de 2023

Fundo

Ensaios massivamente paralelos e NGS aumentar o rendimento e a velocidade na investigação biomédica, crucial para a descoberta de anticorpos e outras biomoléculas. No entanto, os métodos de seleção tradicionais e o NGS por si só podem sofrer de preconceitos e ineficiências. O método de "triagem profunda" integra NGS com triagem funcional para identificar de forma eficiente anticorpos de alta afinidade a partir de grandes bibliotecas, acelerando a descoberta de meses para apenas alguns dias e melhorando o desempenho através de aprendizagem automática.

Materiais e Métodos

Resultados

Neste estudo de prova de conceito, foi aplicada uma triagem profunda a uma biblioteca de exibição de levedura para a descoberta rápida de ligandos de alta afinidade. Após etapas de pré-seleção, o método combinou sequenciação extensa e triagem funcional para identificar 47 e 53 candidatos únicos a partir das seleções MACS e FACS, respetivamente. A técnica demonstrou eficácia em correlacionar altos sinais de fluorescência com baixas afinidades de ligação em nanomolar e revelou a vantagem da triagem profunda em fornecer uma visão abrangente do desempenho da biblioteca, superando alguns preconceitos inerentes aos métodos de seleção tradicionais.

Fig. 1: Triagem profunda de uma biblioteca pré-selecionada em exibição de levedura.

O estudo demonstra que a triagem profunda pode descobrir de forma eficiente anticorpos de alta afinidade diretamente a partir de uma biblioteca de scFv não selecionada. Ao aplicar esta abordagem a uma biblioteca derivada de um candidato principal, IL70001, os investigadores identificaram múltiplos Fabs de alta afinidade em picomolares contra a interleucina-7 humana, alcançando uma melhoria de até 2.300 vezes em relação ao anticorpo parental. A triagem profunda contorna os preconceitos de pré-seleção, proporcionando uma via rápida e direta para anticorpos de alta afinidade, com propriedades promissoras para um desenvolvimento adicional.

Fig. 2: Triagem profunda de uma biblioteca de scFv não selecionada.

Conclusão

A triagem profunda é um método de alto rendimento que utiliza sequenciação avançada para encontrar diretamente anticorpos de alta afinidade a partir de bibliotecas não selecionadas. Melhora a afinidade e a potência em até 10.000 vezes em apenas três dias, fornecendo dados digitais detalhados sobre interações de anticorpos e apoiando a descoberta eficiente de clones raros de alta afinidade.

Referência

1. Porebski B T, Balmforth M, Browne G, et al. Descoberta rápida de anticorpos de alta afinidade através de sequenciação massivamente paralela, exibição de ribossomas e triagem de afinidade. engenharia biomédica da Nature, 2024, 8(3): 214-232.