Sequenciação de RNA de célula única

A CD Genomics oferece um serviço de investigação de transcriptoma robusto até níveis de entrada de células únicas em amostras de alta qualidade. Estes padrões globais de expressão génica em células únicas já avançaram dramaticamente a biologia celular.

A Introdução ao scRNA-seq

As células são a unidade básica da vida e cada célula é única. A capacidade de revelar eventos celulares complexos em sistemas biológicos é fundamental para uma melhor compreensão das contribuições celulares durante o desenvolvimento ou na progressão de doenças. A pesquisa sobre a expressão génica com resolução a nível de célula única em amostras compostas por populações celulares mistas permite uma profunda compreensão da complexidade do transcriptoma de diversos tipos celulares.

A sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) é uma sequenciação de alto rendimento tecnologia projetada para explorar a expressão genética ao nível de células individuais. O advento desta tecnologia capacitou os investigadores a aprofundar-se nos perfis de expressão genética de células únicas, revelando assim a heterogeneidade e as diferenças funcionais entre as células. Ao empregar scRNA-seq, os cientistas podem adquirir perfis de expressão genética abrangentes de células individuais, o que facilita a revelação da heterogeneidade celular, das trajetórias de desenvolvimento e da classificação dos tipos celulares.

A CD Genomics oferece ferramentas de excelência para preparação de bibliotecas e sequenciação a partir de uma única célula, algumas células e entradas ultra-baixas de RNA. Combinando a robusta tecnologia de síntese de cDNA com as tecnologias de sequenciação e análise de próxima geração da Illumina, oferecemos dados fiáveis da mais alta qualidade para estudar a heterogeneidade do transcriptoma célula a célula.

Vantagens do scRNA-seq

• Alta SensibilidadeA sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) destaca-se na deteção de expressões genéticas de baixa abundância, permitindo a identificação de genes e transcritos raros que poderiam ser perdidos por métodos tradicionais.
• Alta ResoluçãoEsta tecnologia de ponta permite a medição precisa da expressão génica dentro de células individuais, elucidando diferenças subtis e processos de diferenciação complexos entre elas.
• Alto RendimentoA scRNA-seq pode avaliar simultaneamente os níveis de expressão de numerosos genes, proporcionando assim uma visão holística e detalhada dos padrões de expressão gênica celular.
• Compreensão Abrangente das Características CelularesAtravés da análise detalhada da expressão genética a nível de célula única, os investigadores podem alcançar uma compreensão mais profunda e subtil das funções celulares e características intrínsecas.
• Descoberta de Novos Tipos de Células e Marcadores de DoençaA scRNA-seq ajuda na descoberta de tipos celulares previamente não identificados e de novos marcadores de doenças, contribuindo para avanços no diagnóstico de doenças e no desenvolvimento de terapias direcionadas.
• Ampla Gama de AplicaçõesEsta tecnologia versátil é aplicável a uma ampla gama de amostras, incluindo tecidos, órgãos, embriões e tumores, e é fundamental para o avanço da investigação em áreas como medicina, ecologia e ciências ambientais.

Aplicações de scRNA-seq

Pesquisa de Tumores

• Revelando a Heterogeneidade das Células Tumorais
• Monitorização da Progressão Tumoral
• Análise de Células Imunes
• Mecanismos de Evasão Imunológica e Resistência a Medicamentos

Diferenciação de Células-Tronco

• Rastreio de Alterações na Expressão Génica
• Genes e Vias Regulatórias Chave

Neurobiologia

• Estudo de Células Neuronais e Gliais
• Explorando a Dinâmica da Expressão Génica no Desenvolvimento Neural
• Investigação da Base Molecular das Doenças Neurológicas

Biologia do Desenvolvimento

• Determinação do Destino Celular e Formação de Tecidos
• Compreender Distúrbios do Desenvolvimento e Doenças Genéticas

Regulação Imune

• Análise da Expressão Génica em Células Imunes
• Respostas Imunológicas em Infeções, Inflamação e Doenças Autoimunes

Fluxo de Trabalho de scRNA-seq

O advento de tecnologias de separação/partição de células, como a citometria de fluxo e a microfluídica, tornou possível capturar células únicas, e o DNA ou RNA de células únicas é amplificado para sequenciação de célula única. O fluxo de trabalho geral para a sequenciação de RNA de célula única está delineado abaixo.

Descrição das Técnicas

Fluxo de Trabalho de mRNA de Célula Única Fluidigm C1Com o sistema Fluidigm C1, oferecemos um serviço de perfilagem do transcriptoma de células individuais numa escala opcional. O C1 pode capturar e processar células individuais de forma rápida e fiável. Os passos no fluxo de trabalho Integrated C1 Single-Cell mRNA Seq incluem circuitos fluidos (IFCs) para capturar células, converter RNA poliA+ em cDNA de comprimento completo e realizar amplificação universal do cDNA. Com os circuitos microfluídicos personalizáveis, o C1 permite uma transição sem costura desde a identificação de populações celulares críticas até à geração de bibliotecas de sequenciação para contagem do extremo 3′ do transcriptoma, sequenciação de mRNA de comprimento completo, sequenciação de DNA, análise epigenética, perfilagem de expressão de micro-RNA e muito mais.

SMART-seq Ultra Low Input RNA para sequenciaçãoA tecnologia SMART fornece informações de transcritos completos, permitindo a análise de isoformas de transcritos, fusões de genes, mutações pontuais, etc. O kit que utiliza esta tecnologia permite aos utilizadores realizar a síntese de cDNA diretamente a partir de 1 a 1.000 células intactas ou RNA total de ultra-baixa entrada, com alta reprodutibilidade e representação precisa de transcritos ricos em GC. Bibliotecas de cDNA de comprimento completo produzidas com este kit são compatíveis com plataformas Illumina.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Tipo de amostra: Suspensão de células únicas, tecido fresco Quantidade e Qualidade Recomendada: 2×106 células Quantidade e Qualidade Mínimas: 1×106 células Nota: Os montantes de amostra são indicados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento As opções de serviço flexíveis incluem HiSeq X e MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400.
	Análise Bioinformática Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Caracterização avançada de tipos celulares Refinamento das populações celulares de destino através de reclustering Análise de variação de conjuntos de genes (GSVA) Análise integrada de expressão diferencial (iDEA) Evolução dos estados populacionais celulares Análise de temporização proposta Análise de taxas para transições celulares Exploração de trajetórias Mais mineração de dados a seu pedido. Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em Sequenciação de RNA de Células Únicas para a sua escrita (personalização)

A conferência de Sequenciação de Células Únicas da CD Genomics foca nas ligações entre a variação celular nos tecidos e a função dos órgãos, além de elucidar as origens das doenças. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Referências

1. Wu, AR et al.Avaliação quantitativa de métodos de sequenciação de RNA de célula única. Métodos da Natureza. Janeiro de 2014; 11(1): 41–46.
2. Picelli, S et al.Sequenciação de RNA de comprimento total a partir de células únicas usando Smart-seq2.Protocolos da Natureza. Jan 2014;9(1):171-81.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

1. Qual é o propósito da sequenciação de RNA de célula única?

O objetivo da sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) é explorar o intricado mundo dos perfis de expressão génica de células individuais. Ao contrário da sequenciação de RNA em massa tradicional, que faz uma média dos sinais de uma mistura de células, a scRNA-seq permite que os investigadores dissecem a composição genética única de cada célula. Esta tecnologia é fundamental para descobrir a heterogeneidade celular, identificar tipos celulares raros, acompanhar processos de desenvolvimento a um nível detalhado e elucidar como as células respondem de forma diferente em vários contextos biológicos, incluindo doenças.

2. Qual é a diferença entre RNA-Seq e scRNA-seq?

Tradicional Sequenciação de RNA (RNA-Seq) normalização e sequenciação. Este método permite a obtenção de perfis de expressão gênica detalhados para cada célula, revelando a heterogeneidade celular que pode ser perdida em análises de populações celulares mistas. sequenciação de alto rendimentoConsequentemente, a scRNA-seq permite o exame detalhado da expressão génica em cada célula individual, revelando assim a heterogeneidade celular que o RNA-Seq tradicional não consegue.

3. Qual é a utilidade da análise de pseudotempo?

Em muitos processos biológicos, as células não estão todas sincronizadas na mesma fase temporal. Ao estudar a diferenciação celular utilizando a expressão genética de células individuais, as células capturadas frequentemente abrangem uma ampla gama de diferentes estágios: algumas células ainda não começaram a diferenciar-se, algumas estão em estados intermédios e outras podem ter completado a diferenciação. Como resultado, os perfis de expressão genética entre as células numa amostra podem apresentar uma variabilidade considerável, tornando a análise bastante complexa. A análise de pseudotempo utiliza dados de expressão genética para estimar a distância temporal entre as células. Ao calcular essa distância, pode organizar as células ao longo de uma trajetória de desenvolvimento inferida, representando o caminho mais curto através de todas as células na sua progressão de pseudotempo. Este método ajuda a compreender os tipos de células presentes na amostra e o processo global de diferenciação celular.

4. Como Determinar os Tipos Celulares Específicos em um Agrupamento?

(1) Utilizando Genes Marcadores Conhecidos

a. Baseado em Genes Marcadores EstabelecidosA partir de pesquisas e literatura anteriores, certos tipos de células são conhecidos por expressar especificamente certos genes marcadores, como CD3/CD4 em células T ou CD19/CD20 em células B.

b. Identificação da Expressão de Genes Marcadores dentro de ClustersUtilizando ferramentas como o Loupe Cell Browser ou outro software, os investigadores podem rotular células que expressam genes marcadores específicos para inferir qual cluster corresponde a um tipo celular particular.

c. Utilizando Genes Diferencialmente Expressos ou Genes Marcadores Identificados por SoftwareSoftware como o Cell Ranger e o monocle2 (ou outras ferramentas de análise de célula única) fornece resultados sobre genes diferencialmente expressos dentro de clusters. Se houver genes marcadores conhecidos para um tipo celular, podem ser procurados na lista de genes diferencialmente expressos para inferir se um cluster representa esse tipo celular.

(2) Determinação com Base em Vias Funcionais

a. Quando Genes Marcadores Específicos são DesconhecidosSe os genes marcadores específicos não estiverem claros ou não puderem ser encontrados em certos agrupamentos, os investigadores podem inferir as funções celulares com base nas vias em que os genes diferencialmente expressos ou co-expressos estão envolvidos, utilizando análises de vias KEGG e GO. Esta abordagem ajuda a deduzir as características funcionais e, assim, a identidade dos tipos celulares dentro dos agrupamentos.

A profilagem do transcriptoma de células únicas revela a heterogeneidade dos neutrófilos na homeostase e na infeção.

Revista: Jornal Internacional de Ciências Moleculares

Fator de impacto: 31,250

Publicado: 27 de julho de 2020

Fundo

Os neutrófilos são células imunes diversas que migram para tecidos infectados, respondendo à inflamação ao engolir e destruir patógenos. Eles exibem heterogeneidade devido à diferenciação, influências do microambiente e envelhecimento rápido, o que influencia a sua função e classificação. O sequenciamento de RNA de célula única revela os seus variados perfis transcricionais, oferecendo insights sobre subpopulações de neutrófilos em diferentes estados fisiológicos e de infecção.

Materiais e Métodos

Resultados

Neste estudo, neutrófilos de ratos provenientes da medula óssea, sangue periférico e baço foram analisados utilizando FACS. Dados controlados por qualidade de 19.582 células identificaram sete populações celulares principais e oito clusters de neutrófilos em diferenciação e maduros. A análise da expressão génica destacou 2.922 genes diferencialmente expressos e 24 genes de assinatura, enfatizando genes relacionados ao ciclo celular nas fases iniciais da maturação dos neutrófilos.

Figura 1. Análise de RNA-seq de célula única de neutrófilos da medula óssea (BM), sangue periférico (PB) e baço (SP) em estado estacionário.

Este estudo investiga a heterogeneidade dos grânulos dos neutrófilos e confirma a hipótese do tempo de biossíntese para algumas proteínas, mas identifica inconsistências, sugerindo mecanismos de triagem alternativos. A comparação com classificações baseadas na morfologia alinha assinaturas moleculares, validando o scRNA-seq juntamente com o RNA-seq em massa para compreender os estágios de maturação dos neutrófilos.

Figura 2. (a-f) Paisagem transcricional dos neutrófilos ao longo das trajetórias de diferenciação e maturação.

Este estudo ligou populações de neutrófilos da medula óssea (BM) definidas por scRNA-seq (G0-G4) a subpopulações baseadas em morfologia. Os marcadores CXCR2 e IFIT1 distinguiram as subpopulações G3/G4 e G5 na medula óssea e no sangue periférico (PB), respetivamente, confirmando identidades através da expressão de genes de assinatura. A análise FACS validou as descobertas do scRNA-seq para as proporções das subpopulações de neutrófilos.

Figura 3. Análise das subpopulações de neutrófilos por citometria de fluxo.

A infecção bacteriana altera as populações de neutrófilos na medula óssea (MO). Aumenta a proliferação celular na fase G1 e estabiliza as células na fase G2. As células G3 diferenciam-se principalmente em células G4, com as células G4 a diminuírem na MO, mas a aumentarem no sangue periférico (SP) e no baço (B). As transições entre G5a, G5b e G5c são suprimidas durante a infecção, reduzindo particularmente as populações de G5c. A análise de velocidade destaca dinâmicas alteradas entre subpopulações de neutrófilos na MO, SP e B durante a infecção.

Figura 4. A infeção bacteriana reprograma a estrutura da população de neutrófilos e a transição dinâmica entre cada subpopulação.

Conclusão

Este estudo utiliza a profilagem do transcriptoma de células únicas para delinear a heterogeneidade e maturação dos neutrófilos em condições de estado estacionário e infecção bacteriana. Correlaciona populações de neutrófilos definidas por scRNA-seq com subpopulações de medula óssea baseadas em morfologia tradicional e previamente identificadas, enquanto destaca perfis transcricionais distintos de neutrófilos maduros no sangue periférico.

Referência

1. Xie X, Shi Q, Wu P, et al. A caracterização do transcriptoma de células únicas revela a heterogeneidade dos neutrófilos na homeostase e na infeção. Imunologia da Natureza. 2020, 21(9):1119-33.