Diretrizes para Submissão de Amostras
A CD Genomics oferece um serviço robusto de pesquisa de transcriptoma com níveis de entrada de células únicas em amostras de alta qualidade. Esses padrões globais de expressão gênica em células únicas já avançaram dramaticamente a biologia celular.
A Introdução do scRNA-seq
As células são a unidade básica da vida e cada célula é única. A capacidade de revelar eventos celulares complexos em sistemas biológicos é fundamental para uma melhor compreensão das contribuições celulares durante o desenvolvimento ou na progressão de doenças. A pesquisa sobre a expressão genética em resolução de célula única em amostras compostas por populações celulares mistas permite uma profunda compreensão da complexidade do transcriptoma de diferentes tipos celulares.
A sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) é uma sequenciação de alto rendimento tecnologia concebida para explorar a expressão génica ao nível de células individuais. O advento desta tecnologia capacitou os investigadores a aprofundar os perfis de expressão génica de células únicas, revelando assim a heterogeneidade e as diferenças funcionais entre as células. Ao empregar scRNA-seq, os cientistas podem obter perfis de expressão génica abrangentes de células individuais, o que facilita a revelação da heterogeneidade celular, das trajetórias de desenvolvimento e da classificação dos tipos celulares.
A CD Genomics oferece ferramentas de excelência para a preparação de bibliotecas e sequenciação a partir de uma única célula, algumas células e entradas ultra-baixas de RNA. Combinando a robusta tecnologia de síntese de cDNA com a sequenciação de próxima geração da Illumina e tecnologias de análise, oferecemos dados fiáveis da mais alta qualidade para estudar a heterogeneidade do transcriptoma célula a célula.
Vantagens do scRNA-seq
- Alta SensibilidadeA sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) destaca-se na deteção de expressões genéticas de baixa abundância, permitindo a identificação de genes e transcritos raros que podem ser perdidos por métodos tradicionais.
- Alta ResoluçãoEsta tecnologia de ponta permite a medição precisa da expressão genética dentro de células individuais, elucidando diferenças subtis e processos de diferenciação complexos entre elas.
- Alto RendimentoA scRNA-seq pode avaliar simultaneamente os níveis de expressão de numerosos genes, proporcionando assim uma visão holística e detalhada dos padrões de expressão génica celular.
- Compreensão Abrangente das Características CelularesAtravés da análise detalhada da expressão genética em células individuais, os investigadores podem alcançar uma compreensão mais profunda e subtil das funções celulares e das características intrínsecas.
- Descoberta de Novos Tipos de Células e Marcadores de DoençaA scRNA-seq ajuda na descoberta de tipos celulares previamente não identificados e de novos marcadores de doenças, contribuindo para avanços no diagnóstico de doenças e no desenvolvimento de terapias direcionadas.
- Ampla Gama de AplicaçõesEsta tecnologia versátil é aplicável a uma ampla gama de amostras, incluindo tecidos, órgãos, embriões e tumores, e é fundamental para o avanço da investigação em áreas como a medicina, a ecologia e a ciência ambiental.
Aplicações de scRNA-seq
Pesquisa de Tumores
- Revelando a Heterogeneidade das Células Tumorais
- Monitorização da Progressão Tumoral
- Análise de Células Imunes
- Mecanismos de Evasão Imune e Resistência a Medicamentos
Diferenciação de Células-Tronco
- Rastreio de Alterações na Expressão Génica
- Genes e Vias Regulatórias Chave
Neurobiologia
- Estudo de Células Neuronais e Gliais
- Explorando a Dinâmica da Expressão Génica no Desenvolvimento Neural
- Investigação da Base Molecular das Doenças Neurológicas
Biologia do Desenvolvimento
- Determinação do Destino Celular e Formação de Tecidos
- Compreender os Distúrbios do Desenvolvimento e as Doenças Genéticas
Regulação Imune
- Análise da Expressão Génica em Células Imunes
- Respostas Imunes em Infeções, Inflamação e Doenças Autoimunes
Fluxo de Trabalho de scRNA-seq
O advento de tecnologias de separação/particionamento de células, como a citometria de fluxo e a microfluídica, tornou possível capturar células únicas, e o DNA ou RNA de células únicas é amplificado para sequenciação de célula única. O fluxo de trabalho geral para a sequenciação de RNA de célula única está descrito abaixo.
Descrição das Técnicas
Fluxo de Trabalho de mRNA de Célula Única Fluidigm C1Com o sistema Fluidigm C1, oferecemos um serviço de perfilagem do transcriptoma de células únicas numa escala opcional. O C1 pode capturar e processar células individuais de forma rápida e fiável. Os passos no fluxo de trabalho Integrated C1 Single-Cell mRNA Seq incluem circuitos fluidos (IFCs) para capturar células, converter RNA poliA+ em cDNA de comprimento total e realizar amplificação universal do cDNA. Com os circuitos microfluídicos personalizáveis, o C1 permite uma transição fluida da identificação de populações celulares críticas para a geração de bibliotecas de sequenciação para contagem do extremo 3′ do transcriptoma, sequenciação de mRNA de comprimento total, sequenciação de DNA, análise epigenética, perfilagem de expressão de micro-RNA e muito mais.
SMART-seq Ultra Low Input RNA para sequenciaçãoA tecnologia SMART fornece informações de transcritos de comprimento total, permitindo a análise de isoformas de transcritos, fusões de genes, mutações pontuais, etc. O kit que utiliza esta tecnologia permite aos utilizadores realizar a síntese de cDNA diretamente a partir de 1 a 1.000 células intactas ou RNA total de entrada ultra-baixa com alta reprodutibilidade e representação precisa de transcritos ricos em GC. As bibliotecas de cDNA de comprimento total produzidas com este kit são compatíveis com plataformas Illumina.
Especificações do Serviço
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Requisitos de Amostra
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Estratégia de Sequenciamento
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Análise Bioinformática
Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas:
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Pipeline de Análise
Entregáveis
- Os dados de sequenciação originais
- Resultados experimentais
- Relatório de análise de dados
- Detalhes em Sequenciação de RNA de Célula Única para a sua escrita (personalização)
A conferência de Sequenciação de Células Únicas da CD Genomics foca nas ligações entre a variação celular nos tecidos e a função dos órgãos, além de elucidar as origens das doenças. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.
Referências
- Wu, AR et al.Avaliação quantitativa de métodos de sequenciação de RNA de célula única. Métodos da Natureza. Janeiro de 2014; 11(1): 41–46.
- Picelli, S et al.Sequenciação de RNA de comprimento total a partir de células únicas utilizando Smart-seq2.Protocolos da Natureza. Jan 2014;9(1):171-81.
Resultados da Demonstração
Os resultados parciais estão mostrados abaixo:
Perguntas Frequentes sobre scRNA-seq
1. Qual é o propósito da sequenciação de RNA de célula única?
O objetivo da sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) é explorar o intrincado mundo dos perfis de expressão genética de células individuais. Ao contrário da sequenciação de RNA em massa tradicional, que faz uma média dos sinais de uma mistura de células, a scRNA-seq permite que os investigadores dissecem a composição genética única de cada célula. Esta tecnologia é fundamental para descobrir a heterogeneidade celular, identificar tipos celulares raros, acompanhar processos de desenvolvimento a um nível detalhado e elucidar como as células respondem de forma diferente em vários contextos biológicos, incluindo doenças.
2. Qual é a diferença entre RNA-Seq e scRNA-seq?
Tradicional Sequenciação de RNA (RNA-Seq) normalização e sequenciação. Este método permite a identificação de perfis de expressão gênica únicos para cada célula, revelando a heterogeneidade celular dentro de uma população. sequenciação de alto rendimentoConsequentemente, a scRNA-seq permite o exame detalhado da expressão génica em cada célula individual, revelando assim a heterogeneidade celular que a RNA-Seq tradicional não consegue.
3. Qual é a utilidade da análise de pseudotempo?
Em muitos processos biológicos, as células não estão todas sincronizadas na mesma fase temporal. Ao estudar a diferenciação celular utilizando a expressão genética de células individuais, as células capturadas frequentemente abrangem uma ampla gama de diferentes estágios: algumas células ainda não começaram a diferenciar-se, algumas estão em estados intermédios e outras podem ter completado a diferenciação. Como resultado, os perfis de expressão genética entre as células numa amostra podem apresentar uma variabilidade considerável, tornando a análise bastante complexa. A análise de pseudotempo utiliza dados de expressão genética para estimar a distância temporal entre as células. Ao calcular essa distância, pode organizar as células ao longo de uma trajetória de desenvolvimento inferida, representando o caminho mais curto através de todas as células na sua progressão de pseudotempo. Este método ajuda a compreender os tipos de células presentes na amostra e o processo global de diferenciação celular.
4. Como Determinar os Tipos Celulares Específicos em um Agrupamento?
(1) Utilizando Genes Marcadores Conhecidos
a. Baseado em Genes Marcadores EstabelecidosA partir de pesquisas e literatura anteriores, certos tipos de células são conhecidos por expressar especificamente certos genes marcadores, como CD3/CD4 em células T ou CD19/CD20 em células B.
b. Identificação da Expressão de Genes Marcadores dentro de AgrupamentosUtilizando ferramentas como o Loupe Cell Browser ou outro software, os investigadores podem rotular células que expressam genes marcadores específicos para inferir qual cluster corresponde a um tipo celular particular.
c. Utilizando Genes Diferencialmente Expressos ou Genes Marcadores Identificados por SoftwareSoftware como o Cell Ranger e o monocle2 (ou outras ferramentas de análise de células únicas) fornece resultados sobre genes diferencialmente expressos dentro de clusters. Se houver genes marcadores conhecidos para um tipo celular, podem ser procurados na lista de genes diferencialmente expressos para inferir se um cluster representa esse tipo celular.
(2) Determinação com Base em Caminhos Funcionais
a. Quando os Genes Marcadores Específicos são DesconhecidosSe os genes marcadores específicos não estiverem claros ou não puderem ser encontrados em certos clusters, os investigadores podem inferir as funções celulares com base nas vias em que os genes diferencialmente expressos ou co-expressos estão envolvidos, utilizando análises de vias KEGG e GO. Esta abordagem ajuda a deduzir as características funcionais e, assim, a identidade dos tipos celulares dentro dos clusters.
Estudos de Caso de scRNA-seq
A profilagem do transcriptoma de células únicas revela a heterogeneidade dos neutrófilos na homeostase e na infecção.
Revista: Jornal Internacional de Ciências Moleculares
Fator de impacto: 31,250
Publicado: 27 de julho de 2020
Fundo
Os neutrófilos são células imunes diversas que migram para tecidos infectados, respondendo à inflamação ao engolir e destruir patógenos. Eles exibem heterogeneidade devido à diferenciação, influências do microambiente e envelhecimento rápido, o que influencia a sua função e classificação. O sequenciamento de RNA de célula única revela os seus perfis transcricionais variados, oferecendo insights sobre subpopulações de neutrófilos em diferentes estados fisiológicos e de infecção.
Materiais e Métodos
Preparação de Amostras
- Linhas de ratos
- Isolamento de neutrófilos de rato
- Coleta de amostras humanas
- Sangue periférico
- Coleta de células únicas
- Extração total de RNA
Sequenciação
- Construção de biblioteca
- Illumina NovaSeq6000
- RNA-seq
- scRNA-seq
- Correção de lote
- Redução de dimensão
- Agrupamento e anotação não supervisionados
- Identificação de genes diferencialmente expressos
- Análise de atividade diferencial
- Análise da velocidade do RNA
Resultados
Neste estudo, neutrófilos de ratos provenientes da medula óssea, sangue periférico e baço foram analisados utilizando FACS. Dados controlados de qualidade de 19.582 células identificaram sete populações celulares principais e oito clusters de neutrófilos em diferenciação e maduros. A análise da expressão génica destacou 2.922 genes expressos de forma diferencial e 24 genes de assinatura, enfatizando genes relacionados ao ciclo celular nas fases iniciais da maturação dos neutrófilos.
Figura 1. Análise de RNA-seq de célula única de neutrófilos da medula óssea (BM), sangue periférico (PB) e baço (SP) em estado estacionário.
Este estudo investiga a heterogeneidade dos grânulos dos neutrófilos e confirma a hipótese do tempo de biossíntese para algumas proteínas, mas identifica inconsistências, sugerindo mecanismos de triagem alternativos. A comparação com classificações baseadas na morfologia alinha assinaturas moleculares, validando o scRNA-seq juntamente com o RNA-seq em massa para compreender os estágios de maturação dos neutrófilos.
Figura 2. (a-f) Paisagem transcricional dos neutrófilos ao longo das trajetórias de diferenciação e maturação.
Este estudo ligou as populações de neutrófilos da medula óssea (BM) definidas por scRNA-seq (G0-G4) com subpopulações baseadas em morfologia. Os marcadores CXCR2 e IFIT1 distinguiram as subpopulações G3/G4 e G5 na medula óssea e no sangue periférico (PB), respetivamente, confirmando as identidades através da expressão de genes de assinatura. A análise FACS validou os resultados do scRNA-seq para as proporções das subpopulações de neutrófilos.
Figura 3. Análise das subpopulações de neutrófilos por citometria de fluxo.
A infecção bacteriana altera as populações de neutrófilos na medula óssea (MO). Aumenta a proliferação celular na fase G1 e estabiliza as células na fase G2. As células G3 diferenciam-se principalmente em células G4, com as células G4 a diminuírem na MO, mas a aumentarem no sangue periférico (SP) e no baço (B). As transições entre G5a, G5b e G5c são suprimidas durante a infecção, reduzindo particularmente as populações de G5c. A análise de velocidade destaca dinâmicas alteradas entre subpopulações de neutrófilos na MO, SP e B durante a infecção.
Figura 4. A infecção bacteriana reprograma a estrutura da população de neutrófilos e a transição dinâmica entre cada subpopulação.
Conclusão
Este estudo utiliza o perfilamento do transcriptoma de células individuais para delinear a heterogeneidade e maturação dos neutrófilos em condições de estado estacionário e infecção bacteriana. Correlaciona as populações de neutrófilos definidas por scRNA-seq com subpopulações de medula óssea tradicionalmente baseadas em morfologia e previamente identificadas, enquanto destaca perfis transcricionais distintos de neutrófilos maduros no sangue periférico.
Referência
- Xie X, Shi Q, Wu P, et al. A caracterização do transcriptoma de células únicas revela a heterogeneidade dos neutrófilos na homeostase e na infeção. Imunologia da Natureza. 2020, 21(9):1119-33.
