Sequenciação de Células Únicas 10x Genomics

A CD Genomics está agora a oferecer análise de células únicas utilizando várias soluções do sistema 10X Genomics Chromium, permitindo o perfilamento de populações raras ou heterogéneas de células.

A Introdução do Sequenciamento 10x

Abordagens poderosas tornaram-se mais acessíveis, permitindo o perfilamento de populações raras ou heterogéneas de células. A média que ocorre nos métodos convencionais de sequenciação 'bulk' não permite a avaliação direta da unidade biológica fundamental— a célula — ou dos núcleos individuais que empacotam o genoma. A genómica de células individuais (CD genomics) proporciona acesso à análise genómica e genética a nível de célula única, utilizando o sistema 10x genomics e o seu método de entrega de reagentes engenheirados. As plataformas baseadas em gotículas, como o Sistema Chromium 10x, alimentadas pela Tecnologia GemCode, permitem que investigadores biomédicos e clínicos façam novas descobertas importantes utilizando esta abordagem poderosa, assim como as tecnologias e ferramentas necessárias para realizar estudos de célula única. Além disso, as plataformas baseadas em gotículas, maximizando o rendimento de células e, ao mesmo tempo, reduzindo as reações a volumes de nanolitros, demonstraram melhorar a sensibilidade de deteção e a precisão quantitativa. Os métodos baseados em gotículas apresentam vantagens, permitindo a análise direta de tipos celulares raros ou células primárias para as quais pode haver material insuficiente para os protocolos convencionais de sequenciação bulk. Também é ideal para perfilar subpopulações interessantes de células a partir de uma população heterogénea maior, por exemplo, células tumorais malignas dentro de uma massa tumoral, ou células imunes hiper-responsivas dentro de um grupo aparentemente homogéneo. Pode até revelar tipos celulares completamente novos. A genómica 10X também permite estudar estados celulares em cenários como desenvolvimento embrionário, cancro, diferenciação de mioblastos e epitélio pulmonar, e diversificação do destino de linfócitos.

Encapsule a sua amostra em centenas a dezenas de milhares de compartimentos endereçáveis de forma única em minutos, cada um contendo um código de barras identificador para análise posterior. Cada Gel Bead, infundido com milhões de oligonucleotídeos com código de barras, é misturado com uma amostra, que pode ser DNA de alto peso molecular (HMW), células individuais, núcleos ou Cell Beads. Os Gel Beads e as amostras são então adicionados a uma solução de óleo-surfactante para criar Gel Beads em Emulsão (GEMs), que atuam como vesículas de reação individuais nas quais os Gel Beads são dissolvidos e a amostra é codificada com código de barras. Os produtos com código de barras são agrupados para reações posteriores para criar bibliotecas compatíveis com sequenciadores de leitura curta. Após a sequenciação, as sequências de leitura curta com código de barras resultantes são alimentadas em pipelines de análise turnkey que utilizam as informações do código de barras para mapear as leituras de volta ao seu DNA HMW original, célula única ou núcleo único de origem.

Figura 1. Visão esquemática do fragmento de uma biblioteca genómica final 10x Chromium

Solução de Expressão Génica de Célula Única Chromium™

Maximizar o rendimento das células é fundamental para identificar os tipos celulares a partir de tecidos complexos. A Solução de Expressão Génica de Célula Única 10X Genomics Chromium pode ser utilizada para realizar medições do transcriptoma em células individuais, com o sequenciamento de grandes números de células únicas a recapitular a complexidade do transcriptoma em massa. A CD Genomics está dedicada a fornecer um serviço de perfilagem do transcriptoma de célula única de alta qualidade utilizando a Solução de Expressão Génica de Célula Única 10X Genomics Chromium, juntamente com ferramentas de software prontas a usar, que permitem a criação de bibliotecas de alta complexidade a partir de células únicas para maximizar a perceção de qualquer tipo de amostra. Os pipelines de análise Cell Ranger realizam a análise primária e a visualização. Os pipelines de análise Cell Ranger realizam etapas de análise padrão, como demultiplexação, alinhamento e contagem de genes. O Cell Ranger aproveita os Códigos de Barras 10X para gerar dados de expressão com resolução de célula única. Este tipo de dado permite aplicações que incluem agrupamento de células, classificação de tipos celulares e expressão diferencial de genes numa escala de centenas a dezenas de milhares de células.

O Sistema Chromium™ permite o perfilamento transcricional de células únicas de até dezenas de milhares de células (tipicamente 1000-6000), ao particionar as células em GEMs de escala nanoliter, onde todo o cDNA gerado partilha um código de barras 10x comum que é utilizado para associar leituras individuais de volta às partições individuais. A incubação dos GEMs produz cDNA barcoded e de comprimento total a partir de mRNA poli-adenilado. A Biblioteca de Células Únicas 3' consiste em construções padrão de pares de extremidades Illumina que começam e terminam com P5 e P7. O código de barras 10x de 16 bp e os códigos de barras moleculares de 12 bp são codificados na Leitura 1, como os primeiros pares de bases do inserto da biblioteca. As sequências de índice da amostra são incorporadas como a leitura do índice i7.

Figura 2. O fluxo de trabalho de partição celular Chromium™ para sequenciação de scRNA

Os Protocolos de Células Únicas da 10x Genomics requerem uma suspensão de células únicas viáveis ou núcleos únicos como entrada. Os investigadores devem submeter uma suspensão dissociada de células vivas. Para obter dados de alta qualidade, é crucial maximizar a viabilidade e minimizar a presença de agregados nucleares, células mortas, detritos celulares, ácidos nucleicos citoplasmáticos e potenciais inibidores da transcrição reversa. A contagem precisa de células é crítica para o sucesso da aplicação. A suspensão de células únicas entre 700-1200 células/µl é recomendada para uma recuperação ótima das células-alvo. Recomenda-se que a suspensão celular seja contada 3-4 vezes e que o desvio padrão entre todas as contagens seja < 25%.

• Codificação de características: codificação da superfície celular

A tecnologia de codificação de características permite a multiplexação e a deteção de duplicados e/ou a identificação de isoformas de proteínas na superfície celular, a deteção de proteínas para transcritos de baixa abundância e a aumento da especificidade fenotípica.

• Codificação de características: triagem CRISPR

Implementação da triagem CRISPR para realizar triagens genéticas funcionais de alto rendimento e escaláveis em centenas a dezenas de milhares de células individuais simultaneamente.

Solução de Profiling Imunológico de Célula Única Chromium™

A Solução de Profiling Imune de Célula Única Chromium é uma abordagem abrangente para entender o sistema imune adaptativo de centenas a dezenas de milhares de células T e B em humanos ou em ratos, com resolução de célula única. A genómica CD oferece fluxos de trabalho simplificados que permitem passar de suspensão celular para preparação de bibliotecas, sequenciação imune e análise de software, possibilitando a montagem e anotação de segmentos V(D)J de comprimento total e a avaliação simultânea da expressão de TCR, Ig e genes 5' na mesma célula.

Suspensões de células únicas carregadas no sistema são particionadas em GEMs, onde os transcritos são marcados com códigos de barras específicos de células. O cDNA marcado é então agrupado para processamento posterior e preparação da biblioteca. Para a profilagem do repertório imune, o cDNA passa por enriquecimento direcionado para transcritos de receptores T ou B antes da preparação da biblioteca. O protocolo produz bibliotecas Chromium Single Cell V(D)J prontas para sequenciação Illumina.

Para bibliotecas enriquecidas em V(D)J, a Leitura 1 codifica o código de barras 10x™ de 16 bp, códigos de barras moleculares de 10 bp e o Oligo Switch de 13 bp, bem como a extremidade 5' de um transcrito enriquecido. Para bibliotecas de expressão génica 5', a Leitura 1 codifica o código de barras 10x de 16 bp e códigos de barras moleculares de 10 bp. Devido à Fragmentação Enzimática, para ambas as bibliotecas, a Leitura 2 codifica um fragmento interno aleatório do inserto correspondente. As sequências de índices de amostra são incorporadas como a leitura do índice i7. Um esquema das construções da biblioteca final é mostrado abaixo.

Figura 3. Biblioteca Enriquecida de Células Únicas V(D)J de Cromo

Figura 4. Estrutura da Biblioteca de Expressão Gênica 5'

A Solução de Sequenciação de Leituras Ligadas Chromium™

A Solução de Sequenciamento do Genoma Chromium permite que códigos de barras moleculares etiquetem leituras que vêm do mesmo fragmento longo de DNA, o que fornece a informação de longo alcance que falta nas abordagens padrão. Como resultado, conseguimos ligar as leituras curtas usando um código de barras único para cada leitura curta gerada a partir de uma molécula individual. Leituras ligadas podem ajudar a aceder NGS zonas mortas, encontrar mais variantes estruturais, resolver haplótipos e facilmente de novo assemblagens de genomas.

Para análises de genoma completo, o processo começa com DNA genómico de alto peso molecular (HMW), criando bibliotecas prontas para sequenciação de cópias de gDNA barcoded único. Para análises de exoma completo, ao adicionar o Kit de Reagentes Agilent SureSelectXT Human All Exon V6, as bibliotecas de Enriquecimento de Alvo proporcionam um desempenho ótimo na aplicação de exoma também. O desempenho ótimo foi caracterizado em gDNA de entrada com um comprimento médio superior a 65 kb, e este protocolo descreve a extração de gDNA HMW com tamanho ótimo a partir de células vivas.

O Perfil de Número de Cópias de Células Únicas Chromium™

A genómica CD tem a capacidade de sequenciar bibliotecas a partir do DNA de células únicas e analisar os dados genómicos, detetando com precisão eventos de CNV em células únicas.

Baseando-se na tecnologia 10x GEMs, a Solução de CNV de Célula Única Chromium é capaz de perfilar centenas a milhares de células. O DNA de células únicas é etiquetado com códigos de barras dentro das partições de Gel Bead do Cell Bead, e os fragmentos etiquetados são então agrupados para a produção de bibliotecas. Os fragmentos da biblioteca etiquetada podem ser facilmente rastreados de volta às células de onde se originaram, utilizando ferramentas de bioinformática a jusante. Esta abordagem fornece uma forma abrangente e escalável de determinar a heterogeneidade do genoma e mapear a evolução clonal, perfilando centenas a milhares de células em uma única amostra. É mais fácil do que nunca estudar a patogénese complexa, incluindo a progressão do câncer e distúrbios genéticos, em uma escala e resolução sem precedentes. Os eventos de CNV de célula única serão identificados com uma resolução de cerca de 2Mb, mas em grupos de células, os eventos de CNV podem ser detectados com uma resolução de até centenas de Kb.

A Sequenciação ATAC do Chromium™

O sistema 10x Chromium™ projetado para a solução de ATAC de célula única (Assay for Transposase Accessible Chromatin) ajuda a compreender a paisagem regulatória do genoma. Também permite entender a variação epigenética e regulatória em dezenas de milhares de células com a solução de Assay para Transposase Accessible Chromatin (ATAC) de Célula Única da Chromium. Começando com centenas a dezenas de milhares de núcleos, a enzima transposase é utilizada para marcar preferencialmente regiões de DNA acessíveis com adaptadores de sequenciação. Fragmentos de DNA transpostos de núcleos individuais são distinguidos com um dos ~750.000 possíveis códigos de barras 10x. Perfila de 500 a 10.000 núcleos por canal e investiga perfis de cromatina aberta de núcleos individuais.

Vantagens do Sequenciamento de Células Únicas 10x

• Alto Rendimento CelularO sistema microfluídico "double-cross" apresenta uma configuração de 8 canais, permitindo capturar até 10.000 células por canal. Isso possibilita a análise de 50.000 a 80.000 células amostrais em uma única corrida em todos os oito canais.
• Alto Cobertura de Sequenciamento de Célula ÚnicaA profundidade de sequenciamento atinge uma média de 50.000 leituras por célula.
• Alta Eficiência de Captura de CélulasCom uma eficiência de captura de células únicas de até 65%, o sistema pode identificar com precisão tipos celulares raros, facilitando a investigação de amostras raras ou aquelas com um número reduzido de células.
• Sequenciação de Células Únicas VerdadeiraA probabilidade de um único GEM (Esfera de Gel em Emulsão) capturar múltiplas células é extremamente baixa (menos de 0,09% por 1.000 células).
• Adaptabilidade de Células AmplaO sistema não impõe restrições ao tamanho das células (células com diâmetros superiores a 40 μm requerem a preparação dos núcleos celulares) ou ao tipo de célula, acomodando células de tecido, células imunes, células sanguíneas, células de tecido cancerígeno, células neuronais, entre outras.

Aplicações de Sequenciação de Células Únicas 10x

Estudos Imunológicos

• Identificação de Subtipos de Células Imunes: Utilizar tecnologia de célula única para identificar e rotular diferentes subtipos de células imunes.
• Análise da Diversidade Genética: Analisar a diversidade genética das células imunes e a alta heterogeneidade causada por patógenos.
• Descoberta de Novos Genes Marcadores: Identificar tipos raros de células imunes, descobrir novos genes marcadores e estudar os mecanismos moleculares das respostas imunes.

Pesquisa de Tumores

• Identificação de Subtipos de Células Tumorais: Reconhecer diferentes subtipos de células dentro de tumores, fornecendo dados genéticos e transcriptómicos precisos.
• Investigação da Heterogeneidade Tumoral: Estudar a heterogeneidade das células tumorais, o agrupamento e a descoberta de novos tipos celulares, à procura de novas vias patogénicas e mecanismos.

Pesquisa sobre Desenvolvimento Neural

• Análise da Heterogeneidade Neuronal: Investigar a heterogeneidade e o agrupamento de diferentes células neuronais.
• Análise do Mecanismo de Regulação Molecular: Analisar os mecanismos de regulação molecular e diferenciação das células neuronais, ajudando a compreender os mecanismos das doenças neurais.

Pesquisa sobre o Desenvolvimento Cerebral

• Atlas de Expressão Génica do Cérebro Humano: Obtenha um atlas de expressão génica das células do cérebro humano, analise a heterogeneidade celular e grupos celulares complexos.
• Compreensão da Função e Mecanismos: Compreender a função normal e os mecanismos anormais do cérebro humano.

Tipificação de Doenças

• Descoberta de Tipos de Células Anormais: Encontrar tipos de células que proliferam anormalmente para ajudar na tipificação de doenças.

Diferenciação de Células-Tronco

• Análise da Heterogeneidade Celular: Analisar a heterogeneidade das células-tronco e identificar células de diferentes fenótipos.
• Descoberta de Marcadores Específicos: Encontrar marcadores específicos de diferentes tipos de células estaminais e analisar os mecanismos moleculares do desenvolvimento e diferenciação das células estaminais.

Pesquisa sobre o Desenvolvimento de Células Embrionárias

• Construção de Linhagens Celulares: Estudar a construção de linhagens celulares com base nas características de diferentes subtipos celulares para ajudar na tipificação de doenças.

Construção do Atlas Celular

• Reconhecimento de Novos Tipos de Células: Identificar com precisão vários tipos de células através da análise do transcriptoma de célula única e descobrir novos tipos de células e genes marcadores.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Célula Única 10x

O fluxo de trabalho abrangente para a preparação de bibliotecas de células únicas utilizando 10x Genomics abrange três etapas principais: a preparação de uma suspensão de células únicas, a construção de GEMs (Gel Bead in Emulsion) e a construção da biblioteca. Isso é seguido pela lise celular e transcrição reversa, sequenciação e análise de dados. A CD Genomics garante que o processo de Sequenciação de Células Únicas da 10x Genomics seja executado com total integridade, precisão e eficiência.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Quantidade e Qualidade Recomendada das Células: 1-103As células individuais são armazenadas em tampão 1xPBS (sem Ca).2+, Mg2+), o volume está dentro de 2 μL Concentração celular: 700-1200 células/μL Nota: Os montantes de amostra são indicados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento 10x Genomics 50000 leituras/células A taxa de captura atinge 65%
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade de dados Alinhamento de genomas Contagem de células Análise da expressão génica Análise diferencial de genes marcadores Análise de tipo celular Análise de pseudotempo Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em Sequenciação de Células Únicas 10x para a sua escrita (personalização)

Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Os resultados parciais estão apresentados abaixo:

1. Por que realizar investigação em sequenciação de células únicas?

A heterogeneidade existe mesmo entre células adjacentes dentro do mesmo tecido, como os tecidos cerebral ou cardíaco. Isto é particularmente pronunciado em tumores, que são amalgamações de várias células mutadas. O sequenciamento convencional em massa, que analisa o material genético de uma mistura de células dentro de um tecido e seu microambiente, pode obscurecer informações críticas devido à heterogeneidade celular. Em contraste, o sequenciamento de célula única resolve este problema ao aumentar significativamente a resolução da análise de sequenciamento ao nível de célula única. Esta precisão permite uma compreensão mais precisa da informação genética e fornece insights poderosos sobre o desenvolvimento individual e a pesquisa de doenças.

De 2013 a 2020, a tecnologia de sequenciação de células únicas tem sido consistentemente destacada como uma tecnologia inovadora anual por revistas prestigiadas como a Science e a Nature. Esta técnica está a conduzir uma nova onda de revolução no campo da investigação biomédica.

2. Quais Produtos de Célula Única a 10x Genomics Oferece Atualmente?

A 10x Genomics oferece um conjunto de soluções de célula única baseadas no seu sistema Chromium, que utiliza a avançada tecnologia 10x Next GEM. Estas soluções incluem:

• Transcriptómica de Célula ÚnicaPara análise da expressão génica a nível de RNA.
• Sequenciação CNV de Célula ÚnicaPara examinar variações no número de cópias (CNVs) ao nível do DNA.
• Deteção de Proteínas por Código de BarrasPara a caracterização de proteínas de superfície utilizando codificação de características.
• Perfilagem Imune de Célula Única (V(D)J-Seq)Para uma análise imunológica abrangente, incluindo o perfil dos repertórios de receptores de antígenos das células imunes.
• ATAC-Seq de Célula ÚnicaPara avaliar a acessibilidade da cromatina e fornecer informações sobre a paisagem epigenética.

3. A Sequenciação de Células Únicas é Atualmente Viável para Plantas?

Ao contrário do sequenciamento de células únicas em animais, a investigação de células únicas em plantas ainda está em sua infância. Um desafio significativo decorre da presença da parede celular das plantas, que exige a preparação de protoplastos antes de criar suspensões de células únicas. Este processo é frequentemente complicado por questões relacionadas aos tempos de digestão enzimática e à osmolaridade dos tampões. Além disso, a menor heterogeneidade celular dentro dos tecidos vegetais complica os esforços de agrupamento celular. Além disso, o tamanho de certas células vegetais pode ser demasiado grande para ser compatível com a plataforma 10x Genomics, tornando o sequenciamento de células únicas mais desafiador.

Sequenciação de RNA de Célula Única Resolve Relações Moleculares Entre Células Vegetais Individuais

Jornal: Fisiologia das Plantas

Fator de impacto: 7,479

Publicado: 04 de Fevereiro de 2019

Fundo

Diferentes tipos de células em organismos resultam de variações na expressão génica, o que é crítico para funções multicelulares. A sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) revolucionou a nossa compreensão da expressão génica dentro das células, particularmente em animais, revelando padrões diversos e tipos raros. A sua aplicação em plantas enfrenta desafios como a isolação de células dentro da parede celular, no entanto, estudos recentes nas raízes de Arabidopsis utilizando scRNA-seq fornecem insights sobre a expressão génica e o desenvolvimento, mostrando potencial para a biologia das plantas.

Materiais e Métodos

Resultados

Este estudo utilizou a plataforma 10X Genomics Chromium para analisar 7522 transcriptomas de células únicas a partir das pontas das raízes de Arabidopsis, revelando uma alta reprodutibilidade e identificando nove principais grupos celulares. A expressão diferencial de genes e a análise de GO destacaram funções específicas dos tecidos, como genes relacionados a pelos radiculares e ao estelo. A análise de genes marcadores permitiu a atribuição precisa de grupos a tecidos radiculares distintos. A análise de subgrupos dentro do estelo identificou tipos celulares específicos, como xilema e floema, demonstrando a capacidade do conjunto de dados para descobrir subtipos celulares raros. Os gradientes de expressão gênica entre os grupos indicaram dinâmicas de desenvolvimento, ilustrando um padrão de diferenciação espacial desde células meristemáticas até células maduras.

Figura 1. Análise de isolamento e agrupamento de transcriptomas de células únicas a partir de raízes de Arabidopsis selvagem.

Figura 2. A expressão do gene marcador do estelo em gráficos de projeção tSNE define clusters de tipos de tecido e células distintos no estelo.

Figura 3. Variação no desenvolvimento intracluster na expressão génica.

Neste estudo, a sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) foi utilizada para analisar a epiderme radicular dos mutantes rhd6 e gl2 com alta resolução. A análise revelou fenótipos moleculares distintos: os mutantes rhd6 não apresentavam células de pelos radiculares, com algumas células adotando características de não pelos, enquanto os mutantes gl2 não apresentavam células de não pelos, com algumas células a expressar marcadores precoces de não pelos. Estas descobertas sublinham a eficácia do scRNA-seq na identificação de alterações na expressão génica específicas de tipo celular e na caracterização de fenótipos mutantes a nível de célula única.

Figura 4. Análise comparativa do transcriptoma de células únicas das raízes de tipo selvagem e das raízes do mutante da epiderme radicular.

Conclusão

A sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) tem sido menos explorada em plantas em comparação com animais. Os autores utilizaram uma plataforma de microfluídica baseada em gotículas para realizar scRNA-seq de alto rendimento em mais de 10.000 células radiculares de Arabidopsis, revelando diversos tipos de tecidos e estágios de desenvolvimento. Identificaram tipos celulares raros, como células do centro quiescente, e traçaram trajetórias de desenvolvimento em células epidérmicas radiculares, incluindo mutantes, demonstrando o potencial do scRNA-seq para uma análise detalhada da expressão génica em plantas.

Referência

1. Ryu KH, Huang L, Kang HM, et al. A sequenciação de RNA de célula única resolve relações moleculares entre células vegetais individuais. Fisiologia vegetal. 2019, 179(4):1444-56.