Serviço de Genotipagem de Microsatélites

A CD Genomics tem uma vasta experiência em fornecer apoio na seleção e design de marcadores de microsatélites para uma ampla gama de espécies de plantas e animais. Além da genotipagem de microsatélites, também oferecemos genotipagem por sequenciação (GBS) método, que poupa tempo e recursos.

A Introdução do Genotipagem de Microsatélites

Microssatélites, também conhecidos como repetições de sequência simples (SSRs) ou repetições em tandem curtas (STRs), têm sido marcadores populares devido ao seu elevado polimorfismo. Genotipagem é uma abordagem precisa, económica e rápida para distinguir alelos de microsatélites, impulsionada por sucessivos avanços técnicos, incluindo PCR em multiplex e sequenciação de próxima geração tecnologias. O fluxo de trabalho completo para genotipagem de microssatélites inclui a aquisição de dados de sequenciação, seleção de SSR, design de primers, validação de primers, PCR em multiplex, e eletroforese em gel capilar acoplada a deteção baseada em fluorescência, bem como análise de dados.

A reação de PCR é realizada com primers marcados com corante fluorescente, e os fragmentos de PCR podem ser analisados em um capilar. Sequenciação de DNA máquina, e os dados são analisados utilizando o GeneMapper^TM software. Ao tirar partido da multiplexação por tamanho de fragmento e cor de corante, e da capacidade das máquinas automatizadas de análise genética fluorescente para carregar automaticamente 16 amostras de cada vez a partir de placas de microtitulação de 96 poços ou até 384 poços, pode-se conceber uma análise de marcadores de alto rendimento. Este serviço foi aplicado a uma ampla variedade de espécies e pode acomodar qualquer espécie para a qual existam marcadores de microssatélites disponíveis.

Se gostaria de saber mais sobre Genotipagem de Microssatélites, pode ler o nosso artigo "Introdução aos Microssatélites e Genotipagem de Microssatélites.

Vantagens da Genotipagem de Microsatélites

Vantagens dos microssatélites como marcadores genéticos:

• Universal e polimórfico
• Marcadores específicos de locus (em contraste com marcadores de múltiplos loci, como os minisatélites)
• Codominante (os heterozigotos podem ser distinguidos dos homozigotos)
• Baseado em PCR (apenas requer pequenas quantidades de tecido e funciona com DNA degradado)
• Múltiplas aplicações (desde a identificação individual até filogenias de alta resolução)

Aplicação da Genotipagem de Microssatélites

A vasta quantidade de dados emergentes para milhares de marcadores de microsatélites em organismos torna a genotipagem de microsatélites uma ferramenta amplamente aceita para:

• Análise de ligação de co-segregação
• Diagnóstico e identificação de doenças humanas
• Identificação forense e testes de parentesco
• Identificação de linhagens celulares
• Estudos populacionais

Fluxo de Trabalho de Genotipagem de Microsatélites

A CD Genomics adota plataformas avançadas (ABI 3730xl DNA Analyzer) e estratégias (PCR multiplex) para fornecer um serviço de genotipagem de microssatélites rápido e preciso, bem como análise bioinformática. A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais. O fluxo de trabalho geral está descrito abaixo.

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra Amostras de tecido, ou DNA já extraído, ou produtos de PCR DNA genómico ≥ 500 ng, Quantidade mínima: 200 ng, Concentração ≥ 10 ng/μl, OD260/280 = 1.8~2.0 Produtos de PCR com alta especificidade Todas as amostras de ADN são validadas quanto à pureza e quantidade.
	PCR de multiplexagem e Genotipagem Seleção de SSR a partir de dados de sequência Desenho e validação de primers PCR de multiplexagem Eletroforese em gel capilar com o Analisador de DNA ABI 3730xl
	Análise de Dados Precisão de dimensionamento Chamada e agrupamento de alelos Análise de agrupamento Medição e reporte de taxas de erro Diversidade genética e estudos populacionais Mais sob pedido

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Procedimento experimental completo,
• Imagens de eletroforese em PCR
• Imagens de deteção de gel grandes
• Sequenciação de cromatogramas
• Resultados da análise de dados

A CD Genomics oferece um pacote completo de serviços de genotipagem de microssatélites, incluindo o design e a encomenda de pares de primers marcados com fluorescência, validação de primers, genotipagem de microssatélites, bem como análise de dados. Podemos adaptar este fluxo de trabalho aos seus interesses de pesquisa. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

1. O que é Genotipagem de Microssatélites?

A genotipagem de microssatélites é uma técnica poderosa utilizada para a deteção e avaliação de variações dentro dos microssatélites, também conhecidos como Repetições de Sequência Simples (SSRs), no DNA. Os microssatélites são sequências curtas repetitivas compostas por 1-6 pares de bases. Estas sequências são consideravelmente variáveis ao longo do genoma, sendo, portanto, excelentes marcadores genéticos.

2. Qual é o Princípio Subjacente à Genotipagem de Microsatélites?

A genotipagem de microssatélites baseia-se no princípio da Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) para a amplificação de locais específicos de microssatélites. Esta técnica envolve o design de primers específicos para amplificar regiões-alvo de microssatélites. Subsequentemente, os produtos amplificados são diferenciados e tipificados com base em variações de tamanho através de técnicas como a electroforese em gel ou a electroforese capilar.

Quais são as vantagens da Tecnologia de Genotipagem de Microssatélites?

A utilização da tecnologia de genotipagem de microssatélites oferece várias vantagens distintas em estudos de variação genética:

• Polimorfismo Proeminente: Os microssatélites são caracterizados pelo seu elevado grau de variabilidade, fornecendo assim uma abundância de informação genética.
• Resolução Precisa: Esta tecnologia de investigação permite uma diferenciação altamente precisa, destacando até mesmo variações genéticas minuciosas entre organismos individuais.
• Distribuição Ampla: Os marcadores de microssatélites permeiam extensivamente o genoma, o que torna esta técnica adequada para diferentes espécies biológicas.

4. Como é que a genotipagem de microsatélites difere de outras tecnologias de genotipagem?

A genotipagem de microssatélites é distinta de Genotipagem de Polimorfismo de Nucleótido Único (SNP) em múltiplos aspectos críticos:

• Polimorfismo Aprimorado: Quando comparado a Genotipagem de SNPsA genotipagem de microssatélites apresenta um nível superior de polimorfismo, tornando-a excepcionalmente adequada para a exploração de regiões genéticas altamente variáveis.
• Finalidades de Aplicação Diferentes: Enquanto a genotipagem de SNPs encontra utilidade convencionalmente na análise de mutações pontuais, a genotipagem de microssatélites destaca-se em estudos que necessitam de uma compreensão mais detalhada da variabilidade genética.

5. Como podem os dados de genotipagem de microssatélites ser processados e analisados?

Os procedimentos para processar e analisar dados de genotipagem de microssatélites incluem:

• Determinação do tamanho de fragmentos: A medição dos tamanhos de fragmentos a partir de eletroferogramas utiliza software especializado.
• GenotipagemCom base no tamanho do fragmento, ocorre a identificação de alelos em loci de microssatélites.
• Análise estatística: Os dados genotípicos são analisados com software estatístico para expor a variabilidade genética e a estrutura populacional.

A genotipagem de microsatélites de alta profundidade e alta precisão permite uma classificação de risco de cancro do pulmão mais precisa.

Revista: Oncogene
Fator de impacto: 7,519
Publicado: 31 de julho de 2017

Fundo

Os microssatélites são uma série de sequências de ADN em tandem que compreendem unidades repetitivas curtas (1-6 pb). Pesquisas recentes destacaram o papel fundamental que estes microssatélites desempenham no intrincado processo de desenvolvimento genético em uma miríade de tipos de câncer. O objetivo principal deste estudo é identificar certos marcadores de microssatélites aplicáveis à estratificação de risco para o câncer de pulmão. Isso será realizado através da comparação de sequências de exoma germinativo entre pacientes com câncer de pulmão e um grupo de controle normativo.

Métodos

Resultados

A metodologia adotada está principalmente dividida em duas fases: (i) identificação de locais de Microssatélites (MST) e (ii) validação do seu estatuto como marcadores significativos. Utilizando dados do The Cancer Genome Atlas (TCGA), que consistem em 488 amostras de tumores germinativos de cancro do pulmão não pequenas células, e do 1000 Genomes Project, que possui 399 amostras de controlo não cancerígenas, a primeira fase concentrou-se em distinguir a variância genética nos locais de MST. Esta análise levou à revelação de 119 locais de MST significativos, sugerindo uma diferença genotípica crucial entre amostras cancerígenas e de controlo. A utilização de métodos analíticos semelhantes identificou 144 marcadores de MST adicionais em outros tipos de cancro. A transição para a segunda fase envolveu o design de um kit de enriquecimento de alvos personalizado contendo 263 (119+144) marcadores de MST, complementado por 84 marcadores de MST de controlo para sequenciação de captura direcionada. A realização de sequenciação profunda de 30 amostras de cancro do pulmão e 89 amostras de controlo não cancerígenas, com uma profundidade média de sequenciação de 579x ± 315, iluminou diferenças pronunciadas em 21 (13+8) marcadores de MST entre os 263 em investigação.

Fig 1. Os loci MST de LUAD e LUSC, obtidos computacionalmente, diferenciam o seu tipo de cancro correspondente de amostras de controlo não cancerígenas do 1000 Genomes com alta sensibilidade (LUAD: 0,87, LUSC: 0,88).

Estudos recentes destacam que diferentes tipos de câncer podem, de fato, partilhar espectros de características oncogénicas comuns. Além de descobrir 13 locais de microssatélites (MST) propícios à estratificação do risco de câncer de pulmão entre dados de câncer de pulmão e não câncer, este estudo também analisou 144 locais de MST de outros tipos de câncer, incluindo câncer de mama, câncer de ovário, melanoma e neuroblastomas. Após uma verificação rigorosa, foi discernido que 8 desses marcadores poderiam ser utilizados de forma eficaz no âmbito da avaliação do risco de câncer de pulmão.

Tabela 1 Loci MST que podem diferenciar precisamente entre amostras de cancro do pulmão e amostras não tumorais.

Fig. 2. Os 13 loci MST específicos para o câncer de pulmão e 8 loci MST específicos para outras doenças podem diferenciar entre os grupos de amostras de câncer de pulmão e de controlo não cancerígeno.

Uma análise mais aprofundada destes 13 locais MST revelou a sua localização dentro da região intrónica de genes. Investigações anteriores sugeriram que o MST na região intrónica poderia influenciar o processo de variante de splicing e a transcrição de genes. A análise de agrupamento destes 13 genes dentro da base de dados DAVID revelou uma visão geral de enriquecimento significativo tanto em variante de splicing como em produto de transcrição. Uma análise de associação destes 13 genes relacionados com o câncer de pulmão indicou que apenas REL e ARID1B foram identificados em pesquisas anteriores como estando relacionados com o câncer. As implicações do TCGA sugerem que estes dois genes poderiam precipitar a ocorrência de câncer de pulmão através de mecanismos de dano ao DNA e remodelação da cromatina.

Conclusão

• Uma análise abrangente de dados relacionados ao câncer do TCGA e do Projeto 1000 Genomas capturou 263 (119+144) locais MST que expressam variações genotípicas significativas entre amostras de câncer e de controlo.
• Ao empregar sequenciação de captura direcionada, foi realizada uma validação eficaz das amostras para estes locais de MST, que revelou 21 (13+8) marcadores de MST capazes de facilitar uma estratificação superior do risco de cancro do pulmão.
• Submetendo os 13 locais MST selecionados a uma análise de agrupamento e enriquecimento, inferiu-se que eles podem estar a influenciar mecanismos de dano ao DNA e remodelação da cromatina, causando consequentemente o câncer de pulmão. Este efeito é predominantemente através de REL e ARID1B.
• Os locais MST não descobertos têm um valor clínico potencialmente significativo. A sua descoberta é fundamental na identificação de novos alvos terapêuticos, na previsão do câncer de pulmão e em processos substanciais de avaliação de risco de câncer.

Referência:

1. Velmurugan KR, Varghese RT, Fonville NC, et al.A genotipagem de microssatélites de alta profundidade e alta precisão permite uma classificação de risco de cancro do pulmão mais precisa. Oncogene. 2017, 36(46):6383-90.