Sequenciação de RNA Total

As análises de RNA-Seq total oferecem uma visão abrangente do transcriptoma. Uma variedade de soluções adaptadas ao propósito do seu estudo está disponível na CD Genomics. Podemos fornecer um serviço rápido, fiável e rentável.

A Introdução da Sequenciação de RNA Total

À medida que o RNA não codificante (ncRNA) continua a ser reconhecido como biologicamente importante, a sequenciação total de RNA (total RNA-Seq) analisa tanto o RNA codificante como várias formas de RNA não codificante para uma visão abrangente do transcriptoma. A análise global da expressão de RNA pode aumentar a nossa compreensão de toda a atividade transcricional. A total RNA-Seq permite a análise de RNA codificante e não codificante com a descoberta de alta confiança de características como transcritos alternativos, fusões de genes, expressão específica de alelos e a deteção de novos transcritos em espécies de RNA codificante e não codificante.

A genómica CD combina quimioterapias comprovadas de preparação de bibliotecas de redução ribossomal e Illumina. NGS tecnologia num único protocolo simplificado. A química de redução de RNA ribossómico Ribo-Zero minimiza a contaminação ribossómica e maximiza a percentagem de leituras mapeadas de forma única. Com um desempenho robusto e consistente, o RNA-seq total abrange ambos mRNA e uma ampla gama de espécies de ncRNA de interesse, incluindo RNA longa não codificante (lncRNA)pequeno RNA nuclear (snRNA), pequeno RNA nucleolar (snoRNA) e outras espécies de RNA.

Vantagens da Sequenciação de RNA Total

• Medição precisa da orientação das fibras e cobertura uniforme.
• Compatível com múltiplos tipos de amostras, incluindo amostras de baixa qualidade, fixadas em formalina e incorporadas em parafina (FFPE)
• Tempo de resposta rápido e a mais alta qualidade de dados
• Custo mais baixo e ampla disponibilidade.
• Análise eficaz do transcriptoma
• A pesquisa de sequenciação do transcriptoma, abrangendo fusões de genes, Indels, SNPs, entre outros, produz taxas de deteção mais elevadas e uma fiabilidade aprimorada.
• Descoberta de novos transcritos e variantes de splicing.
• Análise da expressão génica específica de alelos.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de RNA Total

Os nossos serviços abrangentes de RNA-Seq oferecem o fluxo de trabalho de sequenciação de RNA desde a preparação da amostra até à análise de dados, permitindo um perfilamento rápido e uma profunda compreensão do RNA.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra RNA total ≥ 2 μg, Quantidade mínima: 500 ng, Concentração ≥ 50 ng/µL Células ≥ 2×106 Tecido ≥ 500 mg, Quantidade Mínima: 100 mg O valor de A260:A280 deve estar entre 1,8 e 2,0. Relação OD A260/A280 ≥ 1.8, relação A260/230 ≥ 1.8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar livres de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são listados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento biblioteca de cDNA com inserções de 250~300 bp Illumina HiSeq 150 pb em pares Tamanho dos dados de sequenciação: 10 Gb >40 milhões de leituras
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Pré-processamento de dados Mapa para o genoma de referência Identificação de RNA pequeno/circular Análise de sequências Análise de expressão diferencial análise de genes-alvo de miRNA análise de enriquecimento GO Análise de enriquecimento KEGG ...e mais Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de RNA Total para a sua escrita (personalização)

Apoiado pela nossa equipa de cientistas experientes e tecnologia avançada, a CD Genomics oferece serviços de Sequenciação de RNA Total. Empregamos rigorosas medidas de controlo de qualidade e análises bioinformáticas avançadas para garantir resultados precisos e abrangentes. Se tiver requisitos específicos ou perguntas, não hesite em contactar-nos para mais assistência.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciamento

Distribuição A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

1. Qual escolher: sequenciação de RNA total ou sequenciação de mRNA?

Ao considerar se deve optar por RNA-seq total ou mRNA-seq para Sequenciação de RNAA escolha depende principalmente dos objetivos experimentais, uma vez que existem várias distinções cruciais entre as duas abordagens. A RNA-seq total, também conhecida como sequenciação do transcriptoma completo, é o método mais abrangente que normalmente envolve a sequenciação de todos os tipos de moléculas de RNA, tanto codificantes como não codificantes. A remoção de rRNA durante a RNA-seq total permite a geração de dados de sequenciação de alta qualidade e facilita a caracterização e identificação de várias espécies não rRNA.

Se o foco da pesquisa está nos eucariotos e diz respeito principalmente às regiões codificantes, então o mRNA-seq é a escolha preferida. A metodologia mRNA-seq utiliza técnicas de seleção para enriquecer o RNA poli(A). Uma vez que o mRNA representa apenas uma pequena fração do total de moléculas de RNA, se sequenciar apenas o mRNA for suficiente para os objetivos experimentais, então o mRNA-seq destaca-se como a abordagem mais eficaz e económica.

2. Que tipo de sequenciação é a Sequenciação do Transcriptoma Completo?

O sequenciamento do transcriptoma completo utiliza predominantemente plataformas de sequenciamento de segunda geração com leituras curtas, como o Illumina HiSeq X e o Illumina NovaSeq 6000. Enquanto a terceira geração sequenciação de leitura longa métodos foram reportados, a escolha predominante para RNA-Seq experimentos permanecem tecnologias de segunda geração.

3. Qual é a característica chave do Sequenciamento de Transcriptoma Completo que o distingue de outras abordagens de sequenciamento?

A característica chave do Sequenciamento de Transcriptoma Completo reside na utilização de técnicas de preparação de bibliotecas específicas de cadeia, especificamente a preparação de bibliotecas de RNA específicas de cadeia. Esta metodologia assegura que as bibliotecas de cDNA resultantes preservem a informação direcional das cadeias de RNA originais. Esta característica é fundamental para determinar com precisão a direcionalidade da transcrição, facilitando assim a quantificação precisa da expressão génica, a anotação robusta de genes, a descoberta de novos genes e a identificação fiável de transcritos antisense e eventos de splicing alternativo.

4. Como é que a Sequenciação do Transcritoma Completo contribui para a compreensão da regulação génica e da genómica funcional?

O Sequenciamento do Transcriptoma Completo revoluciona a nossa compreensão da regulação genética e da genómica funcional ao fornecer uma perspetiva holística do transcriptoma. Esta tecnologia de ponta investiga as dinâmicas intrincadas da expressão génica, explorando as subtilezas do splicing alternativo enquanto revela a diversa gama de assinaturas de RNA não codificante inerentes a vários contextos biológicos. A integração de dados de RNA-Seq específicos de cadeia com paisagens genómicas e epigenómicas fornece aos investigadores as ferramentas para desvendar as complexidades das redes regulatórias, revelando jogadores moleculares críticos em processos celulares, patogénese de doenças e cascatas de desenvolvimento. Ao promover uma compreensão profunda dos sistemas biológicos, esta abordagem impulsiona avanços na vanguarda da investigação biomédica, promovendo a inovação e descobertas impactantes.

O sequenciamento do transcriptoma completo revela o panorama transcricional dos neutrófilos associado à tuberculose ativa.

Revista: Frontiers em Imunologia
Fator de impacto: 8,786
Publicado: 18 de agosto de 2022

Resumo

Os neutrófilos desempenham um papel duplo na tuberculose: contribuem para a imunidade inata contra M. tuberculosis, mas também podem exacerbar a inflamação e a patogénese. Sequenciação do transcriptoma a análise dos neutrófilos revela informações sobre as suas respostas complexas, ajudando a compreender a patogénese da tuberculose e a identificar potenciais biomarcadores para diagnóstico.

Materiais e Métodos

Resultados

Neste estudo, a PCA revelou perfis de expressão génica distintos entre grupos de tuberculose ativa (ATB), infeção latente por tuberculose (LTBI) e grupo de controlo saudável (HC). A análise de expressão génica diferencial identificou diferenças significativas, com 183 DEGs em ATB vs. HC e 271 DEGs em ATB vs. LTBI. Padrões de expressão específicos por género foram observados para os genes regulados negativamente em ATB entre os grupos.

Figura 1 Análise da expressão diferencial de neutrófilos em três grupos de amostras.

Os autores realizaram análises de enriquecimento de vias funcionais e GSEA para explorar os papéis dos DEGs. A análise de enriquecimento revelou vias como a sinalização dos receptores do tipo NOD, a sinalização NF-kappa B e a sinalização da resposta imune, significativamente enriquecidas em ATB em comparação com os grupos LTBI e HC. O GSEA destacou vias adicionais como a resposta ao lipopolissacarídeo e a sinalização de quimiocinas. A análise da rede de interação proteica identificou sub-redes centrais envolvendo a sinalização da resposta imune e o splicing de mRNA, notavelmente distintas nas comparações entre ATB e LTBI.

Figura 2 Análise de enriquecimento funcional de genes diferencialmente expressos.

A análise KEGG revelou um enriquecimento significativo da via de sinalização NF-κB no grupo ATB, com downregulação do TNFSF14 e upregulação de inibidores do NF-kappa B (IκBs) como NFKBIA, NFKBID e NFKBIZ. Adicionalmente, TNFAIP3 e NFKB1A foram upregulados, potencialmente inibindo a ativação da via NF-κB. BCL2A1 e CXCL8, associados à sobrevivência celular, também foram significativamente upregulados. Em contraste, as vias relacionadas ao splicing de RNA foram downreguladas em LTBI em comparação com HC, conforme indicado pelas análises de enriquecimento GO, KEGG e Reactome. A análise WGCNA identificou módulos correlacionados positivamente e negativamente com ATB, destacando padrões distintos de co-expressão gênica relacionados aos estados de infecção por TB, particularmente em neutrófilos.

Figura 3 A regulação positiva dos inibidores de NFKB na ATB pode levar à inibição da ativação da via NFKB.

Figura 4 Análise de enriquecimento de vias GO e Reactome em LTBI vs. HC no gráfico de enriquecimento GSEA.

Figura 5 (A) O mapa de calor da matriz de correlação entre módulos e traços do WGCNA.

Nove genes-alvo foram validados por qPCR em 76 amostras, mostrando uma expressão significativamente mais elevada de GBP5, SRSF5, CSRNP1, RBM3 e CCNL1 em ATB. A análise ROC de GBP5, SRSF5, CSRNP1 e RBM3 em 143 amostras confirmou o seu potencial diagnóstico para ATB, com GBP5 a exibir a maior capacidade discriminativa (AUC>0.9).

Figura 6 Gráficos de bolhas da análise de enriquecimento funcional de genes em módulos azuis, mostrando apenas os 15 principais caminhos significativamente enriquecidos.

Conclusão

Este estudo utiliza tecnologia de sequenciação de alto rendimento, combinada com uma análise abrangente, para elucidar o papel dos neutrófilos como uma das células imunes inatas mais abundantes no processo de infeção ativa por tuberculose. Ao reconhecer padrões moleculares associados a patógenos através de uma série de recetores de reconhecimento de padrões, os neutrófilos desencadeiam eventos celulares a jusante na defesa do hospedeiro, envolvendo particularmente vias induzidas pela resposta imune. No entanto, o Mycobacterium tuberculosis pode interferir na função antibacteriana dos neutrófilos ao inibir a via de sinalização NF-kB, atenuando assim a inflamação e a apoptose celular, enquanto promove a sua sobrevivência dentro dos neutrófilos. Através da análise de RT-qPCR, foram identificados três novos genes marcadores transcricionais, RBM 3, CSRNP 1 e SRSF 5, com potencial para diferenciar entre tuberculose ativa, infeção latente por tuberculose e controles saudáveis.

Referência

1. Geng X, Wu X, Yang Q, et al. O sequenciamento do transcriptoma completo revela a paisagem transcricional dos neutrófilos associada à tuberculose ativa. Fronteiras em Imunologia, 2022, 13: 954221.