Análise de Locais de Integração Lentiviral/Retroviral

Introdução à Análise de Locais de Integração Lentiviral/Retroviral

Os vetores lentivirais são amplamente reconhecidos como os principais sistemas de entrega de genes para alcançar a modificação genética estável de células. Estes vetores integram-se no genoma do hospedeiro para facilitar a expressão de transgenes. Embora o processo de integração do genoma de RNA lentiviral—primeiro transcrito reversamente em DNA—seja aparentemente aleatório, a literatura existente indica a presença de hotspots de integração. Dada a possibilidade de a integração lentiviral perturbar a função celular, particularmente através da proximidade a oncogenes ou genes críticos, é imperativo identificar os locais de integração precisos após a infecção. A seleção dos locais de integração influencia significativamente tanto a expressão do transgene quanto o fenótipo da célula hospedeira. Consequentemente, a análise dos locais de integração é uma ferramenta essencial para avaliar a segurança destes vetores e monitorizar a dinâmica clonal das células modificadas in vivo.

O nosso laboratório desenvolveu um conjunto avançado de metodologias para uma análise abrangente dos locais de integração viral. Ao integrar técnicas baseadas em PCR e sequenciação com pipelines de bioinformática proprietários, oferecemos uma precisão e sensibilidade incomparáveis na identificação das posições dos locais de integração e na quantificação das frequências dos vetores virais. O nosso serviço de ponta a ponta abrange amplificação por PCR, construção de bibliotecas, sequenciação de extremidades pareadas (PE) e uma análise rigorosa de bioinformática. Estamos comprometidos em fornecer dados da mais alta qualidade e relatórios analíticos fiáveis, garantindo resultados robustos e reproduzíveis para os nossos clientes.

Métodos para Análise Integrativa de Locais

A exploração inicial dos locais de integração viral utilizou o método de Southern blotting e bibliotecas genómicas para caracterizar as características dos locais de integração. Com o tempo, as técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) substituíram o Southern blotting devido à sua simplicidade e precisão. Dependendo da metodologia de PCR utilizada, a análise dos locais de integração viral pode ser categorizada em PCR reversa, PCR mediada por ligadura (LM-PCR) e PCR mediada por amplificação linear (LAM-PCR).

• PCR inverso

A PCR reversa envolve a circularização de fragmentos de DNA após digestão enzimática. Primers específicos são então desenhados para amplificar sequências que flanqueiam o local de integração viral. No entanto, a baixa eficiência de circularização com ligase limita a sua aplicação generalizada.

• LM-PCR

Na LM-PCR, o DNA é fragmentado enzimaticamente, e adaptadores são ligados a ambas as extremidades dos fragmentos. Primers que reconhecem tanto o DNA viral como as sequências de adaptador fixas são utilizados para amplificar os locais de integração, desbloqueando assim a sua informação posicional. A LM-PCR destaca-se pelo seu princípio simples e facilidade de operação, mantendo a sua relevância desde a sua criação até aos dias de hoje.

• LAM-PCR

LAM-PCR começa com a amplificação linear de DNA, produzindo produtos de cadeia simples. Estas moléculas de cadeia simples são então sujeitas a uma amplificação adicional através da LM-PCR. A introdução da amplificação linear aumenta significativamente tanto a sensibilidade como a especificidade da LAM-PCR, tornando-a superior à PCR reversa e à LM-PCR, e levando à sua ampla adoção.

• Sequenciação de Nova Geração para Integração Lentiviral

Atualmente, a sequenciação de alta profundidade, ou sequenciação de nova geração (NGS), representa a principal plataforma para a deteção de locais de integração lentiviral. O método mais refinado e amplamente utilizado para criar bibliotecas enriquecidas para a análise de locais de integração em aplicações industriais e investigação clínica envolve fragmentação mecânica e preparação de bibliotecas de amplicons baseadas em adaptadores (como técnicas de LM-PCR, como o INSPIIRED). Esta metodologia tem sido aplicada extensivamente na avaliação de segurança de vários projetos clínicos de CAR-T19, bem como em análises farmacodinâmicas retrospectivas relacionadas à proliferação de células CAR-T.

Vantagens do Nosso Serviço de Análise de Locais de Integração Lentiviral/Retroviral

• Técnicas maduras de análise de locais de integração.
• Amostras multiplex para resultados rentáveis.
• Fluxo de trabalho eficaz e tempo de resposta rápido.
• Análise qualitativa e quantitativa.
• Análise bioinformática abrangente.
• Múltiplas abordagens para atingir diferentes objetivos.

Aplicações da Análise de Locais de Integração Lentiviral/Retroviral

Avaliação de Segurança:

• Evitando a Mutagénese de Inserção
• Monitorização dos Efeitos a Longo Prazo

Pesquisa em Virologia:

• Compreendendo o Ciclo de Vida Viral
• Desenvolvimento de Vacinas e Medicamentos Antivirais

Otimização de Modelos Animais Transgénicos

• Aprimoramento da Estabilidade e Expressão
• Reduzir Efeitos Adversos

Medicina Regenerativa e Pesquisa Celular

• Melhorar a Eficiência da Pesquisa
• Rastreio da Destinação Celular

Pesquisa Biológica Básica

• Explorando a Estrutura e Função do Genoma
• Investigação de Rearranjos Genómicos

Fluxo de Trabalho para Análise de Locais de Integração Lentiviral/Retroviral

A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade seguindo cada procedimento para garantir resultados abrangentes e precisos. O nosso fluxo de trabalho de Análise de Locais de Integração Lentiviral está descrito abaixo, incluindo preparação de biblioteca, sequenciação e análise bioinformática.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra amostra de gDNA ≥500ng Nota: Os montantes de amostra são listados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Plataforma Illumina Hiseq/NovaSeq PE150 Para o método LM-PCR (adequado para amostras com sequências LTR conhecidas): construir uma biblioteca com tamanho de inserção de 400~600 bp; saída de dados de 1 Gb. Para o método WGS (apenas adequado para linha celular monoclonal): construir biblioteca de 350bp, ~50X de cobertura.
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade de dados Alinhamento ao genoma de referência e sequências de inserção Deteção de site de integração Anotação do site de integração Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Análise de Locais de Integração Lentiviral/Retroviral para a sua escrita (personalização)

O serviço de análise de locais de integração lentiviral da CD Genomics utiliza o poder da Plataforma Illumina para a deteção de locais de integração e desenvolveu uma abordagem de baixo custo e alta capacidade através da sequenciação por enriquecimento de alvos ou método LM-PCR. Temos o prazer de utilizar a nossa vasta experiência e plataforma avançada para oferecer o melhor serviço e os produtos mais qualificados para satisfazer cada demanda dos nossos clientes.

Referência

1. Dawes JC, Webster P, Iadarola B, et al. LUMI-PCR: um protocolo de PCR mediado por ligação na plataforma Illumina para clonagem de locais de integração, que fornece quantificação molecular de locais de integração. DNA do Crime Organizado. 2020; 11:7.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

1. O que é a Análise do Local de Integração Lentiviral/Retroviral?

A Análise de Locais de Integração de Lentivírus/Retrovírus é uma técnica sofisticada utilizada para examinar como os genomas de lentivírus e retrovírus se integram no genoma da célula hospedeira. Ao identificar e mapear estes locais de integração, os investigadores obtêm informações cruciais sobre os mecanismos de integração viral, avaliam a segurança dos vetores e monitorizam o comportamento in vivo das células transgénicas.

2. Por que é necessária a Análise do Local de Integração?

A análise do local de integração é vital para avaliar a segurança dos vetores virais. Garante que estes vetores não se insiram em regiões críticas do genoma do hospedeiro, o que poderia potencialmente desencadear oncogénese ou outros distúrbios genéticos. Além disso, esta análise ajuda os investigadores a compreender as preferências e os mecanismos da integração viral, fornecendo assim um apoio essencial para o desenvolvimento de abordagens baseadas em vetores que sejam mais seguras e eficazes.

3. Quais são os Passos Básicos da Análise do Local de Integração?

O procedimento fundamental para a análise do local de integração lentiviral/retroviral inclui os seguintes passos:

• Infeção de Células AlvoInfectar as células-alvo com o vetor viral.
• Isolamento de DNA GenómicoExtraia o DNA genómico das células infectadas.
• Digestão com Enzimas de RestriçãoDigestar o DNA genómico isolado utilizando endonucleases de restrição.
• Ligação de Sequências de AdaptadoresLigue as sequências de adaptadores aos fragmentos de DNA digeridos.
• Amplificação por PCRRealize a amplificação por PCR para enriquecer fragmentos de DNA que contêm locais de integração viral.
• Construção de BibliotecaConstrua bibliotecas de sequenciação a partir dos produtos de PCR enriquecidos.
• Sequenciação de Alto DébitoConduzir sequenciação de alto rendimento, como a sequenciação Illumina.
• Identificação de Localização para Análise e Integração de DadosAnalise os dados de sequenciação para identificar e caracterizar os locais de integração viral.

4. Quais Ferramentas e Técnicas são Necessárias?

A análise do local de integração envolve tipicamente as seguintes ferramentas e técnicas:

• Endonucleases de RestriçãoEnzimas utilizadas para digerir o DNA genómico em sequências específicas.
• Amplificação por PCRTécnicas para amplificação seletiva de sequências de DNA contendo locais de integração viral.
• Ligação de AdaptadorO método de anexar sequências de adaptadores a fragmentos de DNA para facilitar o sequenciamento.
• Sequenciação de Alto RendimentoPlataformas como o sequenciamento Illumina para gerar extensos dados de sequências.
• Ferramentas de Análise em BioinformáticaSoftware e algoritmos para alinhamento de sequências (por exemplo, BLAST, Bowtie) e análise de dados (por exemplo, R, Python) para elucidar as localizações dos sítios de integração e as suas características.

Deteção de locais de integração em todo o genoma utilizando sequenciação de longo alcance sem amplificação enriquecida por Cas9

Revista: Pesquisa em ácidos nucleicos
Fator de impacto: 8,278
Publicado: 22 de Fevereiro de 2021

Fundo

Os vectores de entrega de genes, particularmente os lentivírus, são utilizados para inserir material genético nas células. Os avanços na tecnologia de vectores e nos métodos de sequenciação melhoraram a sua segurança e precisão. Novas técnicas como a sequenciação Nanopore MinION permitem o mapeamento preciso dos locais de integração dos vectores, aumentando a nossa compreensão dos seus efeitos.

Materiais e Métodos

Resultados

A análise dos locais de integração revela que os vetores lentivirais se integram aleatoriamente em diferentes modelos celulares e espécies. A maioria das integrações ocorre em regiões gênicas, com uma preferência por intrões em relação a exões, mas não apresenta um padrão significativo ou sobreposição entre diferentes tipos de vetores ou linhas celulares. Esta aleatoriedade indica que os vetores lentivirais não visam regiões genómicas específicas, sugerindo uma distribuição ampla sem viés em relação a oncogenes.

Figura 1. Análise Posicional dos IS Identificados.

Figura 2. Identificação de Múltiplos Locais de Integração (MIS).

Conclusão

O método utilizado neste estudo deteta locais de integração lentiviral sem amplificação de DNA, empregando Cas9 para anexar adaptadores para sequenciação de Nanopore de leitura longa. Esta abordagem fornece resultados mais rápidos do que os métodos tradicionais e evita preconceitos da PCR. Oferece um mapeamento detalhado dos locais de integração com leituras longas, embora exija mais DNA e possa perder alguns locais devido à alta quantidade necessária. O método também pode ser adaptado para outras análises genómicas e revela detalhes genéticos adicionais que não são capturados pelos métodos atuais.

Referência

1. van Haasteren J, Munis AM, Gill DR, et al. Detecção de locais de integração genómica em todo o genoma utilizando sequenciação de longo alcance sem amplificação enriquecida por Cas9. Pesquisa em ácidos nucleicos. 2021, 49(3): e16-.