Diretrizes para Submissão de Amostras
A CD Genomics tem fornecido um serviço de sequenciação do exoma completo flexível e acessível há alguns anos. Utilizamos a plataforma de sequenciação Illumina HiSeq para obter informações sobre variações genéticas de uma forma mais eficiente.
WGS vs WES vs Painéis Alvo: Um Guia Rápido de Seleção de Métodos
Não tem a certeza se precisa de amplitude, profundidade ou de uma lista de genes focada? O ensaio errado pode significar dados em excesso, falta de profundidade ou a ausência de tipos de variantes chave. Utilize o fluxo abaixo para alinhar o alcance à sua questão de investigação.
Fluxo de Decisão Rápido
Q1. Precisa de descoberta em todo o genoma além das regiões codificantes, ou a variação estrutural é o foco principal?
- Sim WGS
- Não → Vá para a Q2
Q2. O seu objetivo é a descoberta ampla ou a triagem de variantes de codificação em muitos genes?
- Sim WES
- Não → Vá para a Q3
Q3. Já tem uma lista de genes definida / uma hipótese rigorosa?
- Sim Painel Direcionado
- Não WES
Q4. Precisa de uma profundidade muito alta num conjunto limitado de locis?
- Sim Painel Direcionado (ou segmentação personalizada)
- Não WES
Estratégia Recomendada
Sequenciamento do Exoma Total (WES)
- Melhor equilíbrio para a descoberta de variantes de codificação com volume de dados gerível.
- Ideal quando precisa de descoberta além de uma lista fixa de genes, sem a complexidade do genoma completo.
Sequenciação do Genoma Completo (SGC)
- Melhor para máxima abrangência e projetos que necessitam de sinais em todo o genoma.
- Espere um maior volume de dados e uma complexidade de análise a montante.
Sequenciação de Painéis de Genes Alvo
- Melhor para uma lista de genes fixa e leituras focadas em alvos de alta profundidade.
- Não destinado a ser descoberto fora do design do painel.
Tabela de Comparação de 1 Minuto
| Fator de decisão | WGS | WES | Painel Direcionado |
|---|---|---|---|
| Âmbito | Genoma inteiro | Exoma codificante de proteínas | Genes/regiões selecionados |
| Melhor para | Largura máxima | Descoberta de programação | Alvos orientados por hipóteses |
| Escala de dados | Alto | Médio | Baixo |
| Estratégia de profundidade | Largo | Equilibrado | Muito alto em metas |
| Esforço de interpretação | Mais alto | Moderado | Mais baixo |
| Limites | Mais gestão de dados | Exoma externo limitado | Painel exterior limitado |
Saiba Mais
A Introdução do Sequenciamento do Exoma Completo
O genoma humano compreende aproximadamente 3×10.nove bases, e contém aproximadamente 180.000 regiões codificadoras (exoma), constituindo cerca de 1,7% do genoma humano. Estima-se que 85% das mutações causadoras de doenças ocorram no exoma. Por esta razão, o sequenciamento do exoma completo tem o potencial de revelar uma maior quantidade de variantes relevantes a um custo muito mais baixo do que sequenciação do genoma completoO sequenciamento do exoma completo é considerado uma forma eficiente e poderosa de identificar as variantes genéticas que afetam fenótipos hereditários, incluindo mutações importantes causadoras de doenças e variações naturais que podem ser utilizadas para melhorar culturas e gado.
O Sequenciamento do Exoma Total utiliza tecnologia de captura do exoma para enriquecer os exões e, em seguida, sequencia estas regiões de forma de alto rendimento. Para ser específico, as amostras de DNA são primeiro fragmentadas e sondas oligonucleotídicas biotiniladas (iscas) são utilizadas para hibridizar seletivamente ao exoma no genoma. Esferas magnéticas de estreptavidina são então usadas para se ligar às sondas biotiniladas. A porção não-alvo do genoma é lavada, e a PCR é utilizada para enriquecer a amostra com DNA da região alvo. Subsequentemente, a amostra é sequenciada pela plataforma Illumina HiSeq. Esta estratégia pode resultar em até 100 vezes de melhoria na cobertura genética do genoma humano. Os dados de sequenciamento validados são então utilizados para análise de variantes e interpretação de pesquisa.
As Nossas Soluções de Sequenciamento de Exoma
Na CD Genomics, oferecemos soluções personalizadas. Sequenciação do Exoma serviços para Humano/Rato e Animal/Planta genomas, proporcionando deteção precisa de variantes e soluções rentáveis.
| Tipo de Serviço | Tamanho de Dados Recomendado | Notas |
|---|---|---|
| Sequenciação do Exoma Humano/Murino | ||
| - Painel Principal | ≥8 Gb @ 100X | Otimizado para cobertura e eficiência |
| - Painel Herdado | ≥11 Gb @ 100X | Deteção aprimorada de SNV/InDel/CNV |
| - Painel Tumoral | ≥20 Gb @ 200X | Suporta TMB, MSI e deteção de fusões. |
| Sequenciação do Exoma de Animais/Plantas | Varia conforme a espécie | Sequenciação direcionada para várias espécies (por exemplo, trigo, milho, gado) |
Explore o nosso Serviços de Sequenciamento de Exoma Humano/Murino ou Opções de Sequenciação do Exoma de Animais/Plantas para encontrar a solução perfeita para a sua pesquisa. Esta solução concisa ajuda-o a selecionar o serviço de sequenciação de exoma apropriado para as suas necessidades de investigação.
Vantagens do Sequenciamento do Exoma Completo
- Custo mais baixo e ampla disponibilidade
- Aumento da cobertura da sequência (acima de 120X)
- Deteção de variantes de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) codificantes tão sensíveis quanto sequenciação do genoma completo
- Um conjunto de dados menor para uma análise mais rápida e fácil em comparação com o sequenciamento do genoma completo.
- Aplicações médicas e agrícolas
Fluxo de Trabalho de Sequenciamento do Exoma Completo
A CD Genomics utiliza o sistema Illumina HiSeq para fornecer sequenciação do exoma completo rápida e precisa, bem como análise bioinformática. A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais. O fluxo de trabalho geral para a sequenciação do exoma completo está delineado abaixo.
Requisitos de Amostra
Os requisitos do projeto podem variar consoante a espécie, o design de captura e os objetivos do estudo. Confirmaremos os limites finais de entrada/controlo de qualidade durante a revisão do design.
| Tipo de amostra | Entrada recomendada (diretriz) | Sugestões de QC | Notas |
|---|---|---|---|
| DNA genómico (gDNA) | ≥ 500 ng | OD260/280 ~1.8–2.0; quantificação Qubit; degradação mínima | Preferido para fluxos de trabalho WES padrão |
| Sangue / Células / Tecido fresco (como fonte de ADN) | Conforme necessário para extrair ≥ 500 ng de gDNA | Forneça informações sobre o método de extração, se disponível. | Podemos aconselhar sobre a extração, se necessário. |
| Tecido FFPE (como fonte de DNA) | Dependente do projeto (frequentemente com entrada mais elevada) | Avaliação de fragmentação DV200 recomendada | A uniformidade da captura pode ser afetada; planeie o QC de forma conservadora. |
| Amostras de baixo input | Dependente do projeto | Avaliação prévia recomendada | Pergunte-nos sobre a viabilidade e a estratégia de segmentação. |
O que verificamos (típico)Quantidade de DNA, pureza, integridade/fragmentação (quando aplicável), pontos de controlo de QC da biblioteca (por exemplo, distribuição de tamanho, indicadores de complexidade).
Estratégia de Sequenciamento
1. Biblioteca e capturaCaptura de exoma baseada em hibridização (tamanho típico do alvo 35–65 Mb).
Modo de sequenciaçãoBibliotecas de índices duplos com extremidades pareadas PE150 (150 pb × 2).
3. Opções de cobertura (profundidade média no alvo):
- WES padrão: ~100×
- WES Profundo: ~200×
- Opção de alta profundidade: ~300× (dependente do projeto)
4. Dados aproximados por amostra (brutos):
- 100×: ~8–12 Gb
- 200×: ~15–22 Gb
- 300×: ~22–30 Gb
5. Relatório de QCdesempenho em alvo, duplicação e distribuição de cobertura (incluindo resumo de cobertura ≥20× em todos os alvos).
Análise Bioinformática
Um padrão, reproduzível bioinformática pipeline para transformar leituras brutas em variantes interpretáveis e saídas de controlo de qualidade.
Pipeline principal (incluído):
- QC de dados brutos:
- Alinhamento
- Cobertura e controlo de qualidade de captura
- Chamada de variantes
- Anotação de variantes
- Relatório resumido
Adicionais opcionais (escolha conforme necessário):
- Análise conjunta a nível de coorte
- Inferência de CNV a partir de dados de exoma
- Análise baseada na família
- Regras de filtragem personalizadas e priorização alinhadas às suas hipóteses/conjuntos de genes.
- Apoio à interpretação a jusante
O Que Receberá (Entregáveis)
Ficheiros de dados (prontos para análise):
- Leituras brutas: FASTQ (+ resumos de QC)
- Leituras alinhadas: BAM/CRAM (+ métricas de alinhamento)
- Chamadas de variantes: VCF para SNVs/indels (e saídas CNV opcionais, se selecionadas)
- Tabelas de variantes anotadas: tabelas no estilo TSV/Excel com colunas configuráveis para filtragem/priorização.
- Pacote de QC e cobertura: métricas-chave de captura/cobertura, resumos de precisão e uniformidade, indicadores de duplicação e de biblioteca.
Relatórios e resumos:
- Relatório do projeto: visão geral concisa da QC de amostras, desempenho de sequenciação/captura e resultados gerais.
- Resumo da variante: contagens por tipo, resumos de distribuição e instantâneas de comparação a nível de coorte (se o fluxo de trabalho da coorte for selecionado)
Ativos reutilizáveis (para a sua equipa):
- Nomeação clara de ficheiros + estrutura de pastas para integração de pipeline
- Descrição pronta dos métodos dos passos de análise para documentação interna e preparação de manuscritos (RUO)
A CD Genomics oferece um pacote completo de serviços de sequenciação do exoma inteiro, incluindo padronização de amostras, captura do exoma, construção de bibliotecas, sequenciação profunda, controlo de qualidade dos dados brutos e análise bioinformática. Podemos adaptar este fluxo de trabalho ao seu interesse de pesquisa. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.
Referência:
- Warr A, Robert C, Hume D, et al. Sequenciação do exoma: perspetivas atuais e futuras. G3: Genes, Genomas, Genética, 2015, 5(8): 1543-1550.
Resultados da Demonstração
Estes gráficos de exemplo destacam os resultados típicos de WES—desempenho de cobertura/QC, resumo de variantes, visão geral de enriquecimento e visualização de sinal em todo o genoma—para uma rápida revisão do projeto.
Perguntas Frequentes sobre Sequenciamento de Exoma Completo
1. Quais são as aplicações do sequenciamento do exoma completo?
O genoma humano contém aproximadamente 180.000 regiões codificantes (exoma), que constituem cerca de 1,7% do genoma humano. Estima-se que 85% das mutações causadoras de doenças ocorram no exoma. Portanto, o sequenciamento do exoma completo é um potencial contributo para a compreensão das doenças humanas. O sequenciamento do exoma completo é uma ferramenta económica e poderosa, especialmente adequada para tamanhos de amostra maiores e alta cobertura. O sequenciamento do exoma completo é utilizado principalmente para investigar a causa genética de doenças tanto mendelianas como comuns, como o câncer e a diabetes.
Figura 1. Aplicação do sequenciamento do exoma completo em uma doença complexa.
2. Que variações pode a sequenciação do exoma completo detectar?
O sequenciamento do exoma completo pode detectar SNPs, InDels e, possivelmente, variações no número de cópias (CNVs).
3. Como posso determinar a profundidade de sequenciamento?
A profundidade de sequenciação é um fator importante para sequenciação de alto rendimentoUm artigo publicado na revista Genomics & Informatics revelou que a profundidade de sequenciação do sequenciamento do exoma completo pode afetar as taxas de descoberta de variações. Para resumir, o número de SNPs e InDels deletérios detectados nas regiões codificantes aumentou apenas fracamente a profundidades superiores a 120×. Em outras palavras, uma profundidade de sequenciação de 120× pode ser considerada razoável ao usar a técnica de sequenciação por captura de exoma para identificar variações significativas em estudos diagnósticos.
4. Quais são as desvantagens do sequenciamento do exoma completo?
O sequenciamento do exoma completo é caracterizado por um custo mais baixo, maior cobertura de sequência, bem como identificação sensível e específica. No entanto, o sequenciamento do exoma completo não consegue detectar variantes estruturais e tem uma visão limitada, ou seja, apenas regiões codificantes. Nem todos os alvos são capturados (aproximadamente 80%) e é difícil capturar regiões ricas em GC.
5. Qual é a diferença entre WES e WGS?
O sequenciamento do exoma completo (WES) foca nas regiões codificadoras de proteínas para uma descoberta eficiente de variantes com um volume de dados gerível, enquanto o sequenciamento do genoma completo (WGS) perfila todo o genoma para uma máxima abrangência e potencial de reanálise.
6. Quais regiões a sequenciação do exoma completo cobre?
O WES foca na captura do exoma das regiões codificadoras de proteínas (tamanho alvo tipicamente na casa das dezenas de megabases, dependendo do design da captura), com cobertura variando entre alvos ricos em GC ou difíceis de capturar.
7. Quais métricas de QC são reportadas para WES?
Reportamos a cobertura chave e o controlo de qualidade da captura, como o desempenho em alvo, duplicação e distribuição da cobertura (incluindo resumos de limiares de cobertura comuns entre alvos) para ajudá-lo a avaliar rapidamente a usabilidade dos dados.
8. Que ficheiros vou receber de um projeto WES?
Os entregáveis típicos incluem FASTQ (leituras brutas), BAM/CRAM (leituras alinhadas), VCF (chamadas de variantes), além de uma tabela de variantes anotadas e um pacote de QC/report conciso (RUO).
9. Podem os resultados do WES ser utilizados para comparação a nível de coorte?
Sim. Para estudos com múltiplas amostras, os resultados podem ser gerados num formato consistente e (opcionalmente) com uma análise consciente da coorte para melhorar a comparabilidade entre amostras e reduzir problemas de interpretação relacionados com lotes.
Referência:
- Kyung Kim, et al. Efeito da Profundidade de Sequenciação do Exoma de Nova Geração na Descoberta de Variantes Diagnósticas. Genómica e Informática2015, Jun; 13(2): 31–39.
Estudos de Caso de Sequenciação do Exoma Completo
Prime mutação missense fora do domínio lipase SERAC1 afetando o tráfego intracelular de colesterol.
Revista: Neurogenética
Fator de impacto: 3,269
Publicado online: 7 de outubro de 2015
Resumo
A síndrome MEGDEL é um erro inato de metabolismo raro. Esta síndrome tem sido associada a mutações no gene que contém o sítio ativo de serina 1 (SERAC1). Os autores relataram uma nova mutação homozigótica no gene SERAC1 através de sequenciação do exoma completo na CD Genomics. Esta é a primeira mutação missense fora do domínio da lipase de serina da proteína que afeta o tráfego intracelular de colesterol.
Resultados
1. Mutações no gene SERAC1
Até à data, 19 mutações no gene SERAC1 foram identificadas em pacientes com síndrome MEGDEL (Tabela 1). Apenas três são mutações missense que estão localizadas dentro do domínio da lipase. A p.D224G é a primeira mutação missense fora do domínio da lipase.
2. Mutação missense (p. D224G)
Usando sequenciação de exoma completo, os autores identificaram uma nova mutação patogénica homozigótica no gene SERAC1. Esta mutação missense alterou um ácido aspártico para glicina (Figura 1d). O papel patogénico de p.D224G é suportado por análise in silico, pela conservação do resíduo de aminoácido mutante (Figura 1d) e pela acumulação de colesterol (Figura 1e).
Figura 1. A posição da mutação D224 em várias espécies (d). Tráfego intracelular de colesterol em fibroblastos derivados de indivíduos saudáveis e dos pacientes com SERAC1. U1866A é um inibidor do tráfego de colesterol.
Referência:
- Rodríguez-García M E, et al. Primeira mutação missense fora do domínio lipase SERAC1 que afeta o tráfego intracelular de colesterol. Neurogenética, 2016, 17(1): 51-56.
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