Serviço de Sequenciação de Metilação de RNA 2'-O

A CD Genomics oferece serviços de Sequenciação de Metilação de RNA 2'-O de última geração, especificamente concebidos para detetar e analisar padrões de metilação 2'-O em moléculas de RNA. A nossa metodologia proporciona alta sensibilidade e precisão, permitindo a identificação exata de nucleotídeos metilados. Este serviço apoia estudos aprofundados sobre a estrutura do RNA, estabilidade e papéis regulatórios em processos biológicos.

O que é a metilação 2'-O do RNA?

A 2'-O-Metilação (Nm) é uma modificação pós-transcricional do RNA, catalisada por 2'-O-metiltransferases, que envolve a substituição de um átomo de hidrogénio no grupo 2-hidroxilo por um grupo metilo. Esta modificação química ocorre na posição 2' da ribose no RNA e é mediada por metiltransferases de RNA ou fibrilarina. Notavelmente, a metilação 2'-O-RNA é uma modificação encontrada de forma ubíqua em várias espécies, incluindo mamíferos, leveduras, plantas e vírus.

Estudos recentes demonstraram que a metilação 2'-O-RNA está presente em diversas moléculas de RNA, como mRNA, tRNA, rRNA e miRNA. Estruturalmente, esta modificação aumenta a hidrofobicidade do nucleótido, aumentando assim a sua estabilidade. As implicações funcionais da metilação 2'-O-RNA foram elucidada em múltiplos processos biológicos; afeta as interações mRNA-proteína, regula a eficiência da tradução do rRNA e participa no reconhecimento do tRNA.

O RNA transferidor (tRNA) possui uma vasta gama de modificações pós-transcricionais cruciais para o exercício das suas funções biológicas. Entre estas, a metilação destaca-se como o tipo mais prevalente de modificação do tRNA, ocorrendo tanto nas bases dos nucleotídeos como na posição 2'-O-ribose (metilação 2'-O). A modificação 2'-O-metilação é comum em arqueias, procariotos e eucariotos, identificada nas posições 4, 6, 18, 32, 34, 39, 44, 54 e 56 dentro do tRNA.

A pesquisa indica que a 2'-O-metilação desempenha um papel regulador na dobra, maturação, estabilidade e precisão do emparelhamento entre anticódon e códon de mRNA do tRNA. Está intimamente associada a processos celulares como crescimento, resposta ao stress e regulação imunológica. Deficiências na 2'-O-metilação do tRNA citoplasmático estão frequentemente ligadas a várias doenças. As enzimas envolvidas na 2'-O-metilação do tRNA apresentam potenciais alvos para o desenvolvimento de fármacos.

Investigar a 2'-O-metilação do tRNA e as suas enzimas modificadoras irá aumentar a nossa compreensão das funções biológicas desta modificação. Além disso, estabelece as bases para explorar os mecanismos patogénicos das enzimas de 2'-O-metilação do tRNA em doenças humanas.

Figura 1. Detecção de Metilações 2'-O do Ribose de RNA (Yuri Motorin, Virginie Marchand, 2018)

A Introdução da Sequenciação de Metilação de 2'-O-RNA

Para detectar mais modificações de 2'-metilação e elucidar mecanismos funcionais biológicos adicionais, foram propostas numerosas técnicas experimentais biológicas. Estas incluem métodos baseados em RNase H, abordagens baseadas em transcrição reversa e estratégias baseadas em PCR. No entanto, estes métodos são frequentemente morosos. Com o avanço das tecnologias de sequenciação, a acumulação de sequências nucleotídicas continua. O núcleo da sequenciação de metilação de 2'-O-RNA reside na identificação dos locais de 2'-O-metilação dentro das moléculas de RNA utilizando métodos químicos ou enzimáticos, seguidos pela localização e quantificação precisas destes locais através de sequenciação de alto rendimento técnicas. A 2'-O-metilação altera as propriedades químicas das moléculas de RNA, permitindo a identificação e localização dessas modificações.

Atualmente, várias metodologias são predominantemente utilizadas para sequenciação de metilação de RNA 2'-O:

• Ribose-seqEsta técnica foca-se no RNA ribossómico (rRNA). Envolve a clivagem enzimática direcionada de cadeias de RNA para libertar ribose 2'-O-metilada, que é posteriormente sujeita a sequenciação de alto rendimento.
• Nm-seqEste método utiliza modificações químicas específicas para rotular locais de 2'-O-metilação. Estas modificações permitem o reconhecimento dos locais de metilação através de reações de transcrição reversa seguidas de sequenciação de alto rendimento.
• Pseudouridina-seq (Ψ-seq)Embora tenha sido projetado principalmente para identificar modificações de pseudouridina (Ψ), este método pode ser integrado com outras técnicas de deteção para facilitar o estudo da 2'-O-metilação.

A CD Genomics oferece um serviço abrangente de deteção de metilação 2'-O-RNA, concebido para identificar a presença de modificações de metilação 2'-O em moléculas de RNA e determinar os locais específicos de metilação 2'-O. Para além do serviço oferecido, a CD Genomics inovou uma gama de produtos destinados à avaliação dos níveis de metilação 2'-O-RNA em diversas moléculas de RNA, incluindo mRNA, LncRNA, pri-miRNA, tRNA e rRNA.

Abordagens Baseadas em Sequenciamento Profundo para a Detecção de 2'-O-metilação

Figura 2. Abordagens baseadas em sequenciação profunda para a deteção de resíduos 2'-O-metilados em RNA (Yuri Motorin, Virginie Marchand, 2018)

Vantagens do Nosso Serviço de Sequenciação de Metilação de RNA 2'-O

• Precisão de Nucleótido IndividualO nosso serviço destaca-se na identificação de modificações de metilação em RNA 2'-O com precisão a nível de nucleótido único. Esta abordagem sofisticada garante uma análise meticulosa das localizações das modificações dentro das moléculas de RNA.
• Deteção Eficiente de Alto RendimentoUtilizando técnicas avançadas de alto rendimento, garantimos a identificação paralela e eficiente de locais de modificação de RNA 2'-O em todo o transcritoma. Esta estratégia permite a avaliação simultânea de múltiplas moléculas de RNA, fornecendo uma visão abrangente dos padrões de metilação de RNA 2'-O.
• Cobertura Abrangente em Espécies de RNAO nosso serviço abrange uma vasta gama de tipos de RNA, incluindo mRNA, LncRNA, pri-miRNA, tRNA e rRNA. Esta análise extensiva garante a identificação de locais de metilação 2'-O-RNA em várias moléculas de RNA, contribuindo para uma compreensão mais detalhada do panorama de modificações.
• Interpretação Bioinformática EspecializadaApoiado por uma equipa de bioinformática experiente, oferecemos serviços de análise de dados especializados, adaptados a diversas necessidades dos clientes. A nossa equipa é proficiente na realização de análises de dados minuciosas, oferecendo interpretações perspicazes dos resultados obtidos a partir de experiências de deteção de metilação de RNA 2'-O.

Aplicações da Sequenciação de Metilação de RNA 2'-O

A sequenciação de metilação de RNA 2'-O tem aplicações importantes em vários campos de investigação, incluindo:

• Investigação em Biologia do RNAEstudo dos papéis da 2'-O-metilação na função, estabilidade e regulação da tradução do RNA.
• Pesquisa de DoençasA 2'-O-metilação está associada a várias doenças (por exemplo, cancro, doenças neurodegenerativas). A tecnologia de sequenciação pode revelar os mecanismos dessas modificações nas doenças.
• Desenvolvimento de MedicamentosA identificação de alvos relacionados com a 2'-O-metilação fornece uma base para o desenvolvimento de novos fármacos.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Metilação de RNA 2'-O

A CD Genomics utiliza plataformas de sequenciação avançadas e anos de experiência para oferecer serviços abrangentes de deteção de metilação de RNA 2'-O. Estes serviços incluem principalmente o processamento de amostras, sequenciação e análise bioinformática subsequente.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Tipos de Amostras: Aceitamos vários tipos de amostras, incluindo células, tecidos e RNA. ARN: 100 μg - 300 μg Tecidos: 500 mg - 5 g Célula ≥ 1 x108 Relação OD A260/A280 ≥ 1,8, relação A260/230 ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar isentas de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Preparação de biblioteca específica Illumina HiSeq PE 50/75/100/150
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Estatísticas da distribuição do sinal de 2'-O-RNA Análise do mapa do transcriptoma metilado em 2'-O-RNA chamada de metilação de 2'-O-RNA Análise conservativa evolutiva Pesquisa de motivos Triagem diferencial de genes em locais de enriquecimento Análise de enriquecimento de vias KEGG Análise de enriquecimento GO Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de Metilação de RNA 2'-O para a sua escrita (personalização)

Explore as modificações de RNA com os serviços de Sequenciação de Metilação 2'-O-RNA da CD Genomics. Oferecemos processamento avançado de amostras, sequenciação precisa e uma análise bioinformática abrangente para identificar e quantificar os locais de metilação 2'-O. Contacte-nos para aprimorar a sua pesquisa com informações detalhadas sobre a metilação de RNA.

Referência

1. Motorin Y, Marchand V. Detecção e análise de 2'-O-metilações de ribose de RNA: desafios e soluções. Genes, 2018, 9(12): 642.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Referência

1. Dai Q, Moshitch-Moshkovitz S, Han D, et al. Nm-seq mapeia locais de 2'-O-metilação em mRNA humano com precisão de base. Métodos da Natureza, 2017, 14(7): 695-698.

1. Por que é que o rRNA é metilado em OH 2' selecionados?

O rRNA (RNA ribossómico) sofre metilação em grupos 2'-OH selecionados devido a várias razões críticas:

Estabilidade EstruturalA 2'-O-metilação contribui significativamente para a integridade estrutural do rRNA. Esta modificação desempenha um papel fundamental na preservação da conformação tridimensional correta do rRNA, que é essencial para a montagem e funcionalidade adequadas do ribossoma.

Resistência à DegradaçãoA metilação na posição 2'-OH aumenta a resistência do rRNA a ribonucleases, enzimas responsáveis pela degradação do RNA. Esta resistência aumentada é essencial para manter a longevidade e a função do rRNA dentro do ribossoma.

Precisão da TraduçãoA 2'-O-metilação é crucial para a fidelidade da síntese de proteínas. Os nucleótidos modificados ajudam no posicionamento preciso dos tRNAs e do mRNA durante a tradução, minimizando assim os erros na síntese de proteínas.

Interacção com Proteínas RibossómicasO rRNA metilado exibe interacções melhoradas com proteínas ribossómicas e outros factores relacionados com a tradução. Estas interacções são vitais para a montagem e estabilidade do complexo ribossómico.

Locais FuncionaisA metilação ocorre em locais específicos que são cruciais para a atividade ribossomal. Estas modificações podem afetar as funções catalíticas do ribossoma e as suas interações com outras moléculas, garantindo assim uma síntese proteica eficiente e eficaz.

2. Que tipos de RNA podem ser analisados para 2'-O-metilação?

Este método de sequenciação pode ser aplicado a vários tipos de RNA, incluindo:

• RNA mensageiro (mRNA)
• RNA ribossómico (rRNA)
• RNA transportador (tRNA)
• RNA nuclear pequeno (snRNA)
• RNA não codificante longa (lncRNA)

3. Por que é que a metilação 2'-O-RNA é importante?

A metilação de RNA 2'-O tem uma importância significativa para vários processos celulares, abrangendo:

• Aumento da Estabilidade do RNA e Resistência à Degradação: Esta modificação confere maior estabilidade às moléculas de RNA, protegendo-as contra a degradação por ribonucleases e outras atividades enzimáticas que poderiam comprometer a integridade do RNA.
• Manutenção das Estruturas Secundárias e Terciárias Adequadas do RNA: Ao influenciar o dobramento e as conformações estruturais do RNA, a 2'-O-metilação assegura que as moléculas de RNA adotem configurações essenciais para as suas funções biológicas.
• Regulação das Interacções RNA-Proteína: Esta metilação facilita interacções específicas e de alta afinidade entre moléculas de RNA e proteínas ligadoras de RNA, que são vitais para vários mecanismos regulatórios mediados por RNA.
• Acurácia e Eficiência na Tradução e Splicing: A 2'-O-metilação ajuda na execução precisa e eficaz dos processos de tradução e splicing, minimizando erros e melhorando a fidelidade e eficiência geral da síntese de proteínas e processamento de RNA.

4. Como devo preparar as minhas amostras para sequenciação de metilação de RNA 2'-O?

Para preparar amostras:

• Utilize tecidos ou células frescas ou devidamente armazenados.
• Siga os protocolos recomendados de extração de RNA para obter RNA de alta qualidade.
• Evite a contaminação por RNase para prevenir a degradação do RNA.

5. Quanto tempo leva o processo de sequenciação de metilação de RNA 2'-O?

O tempo de resposta depende de vários fatores, incluindo o número de amostras, a complexidade da análise e o prestador de serviços. Normalmente, o processo pode levar várias semanas desde a submissão da amostra até a entrega dos dados.

Estudo de Caso 1:

O Nm-seq mapeia locais de 2'-O-metilação em mRNA humano com precisão de base.

Revista: Nature Methods

Fator de impacto: 26,9

Publicado: 28 de fevereiro de 2018

Fundo

As modificações de mRNA, parte do epitranscriptoma, regulam a expressão génica e incluem a 2'-O-metilação (Nm). Nm é abundante em rRNA, tRNA, snRNA e microRNA, sendo essencial para a sua função e estabilidade. Métodos tradicionais de mapeamento, como 2OMe-seq e RiboMeth-seq, identificam os locais de Nm ao detetar pausas na transcrição reversa ou resistência à hidrólise. Os métodos existentes têm dificuldades com RNA raro ou locais de Nm de baixa estequiometria. O novo método Nm-seq utiliza clivagem oxidativa para mapear os locais de Nm com alta sensibilidade e precisão a nível de nucleótido único.

Materiais e Métodos

Resultados

Este artigo apresenta, pela primeira vez, a identificação de milhares de locais de metilação no mRNA das células humanas Hela e 293T e descreve a distribuição desses locais de metilação. Entre eles, a maioria dos locais de metilação (95,7%) está localizada dentro de 2398 genes anotados pelo RefSeq, com 95,9% ocorrendo em genes codificadores de proteínas, e uma pequena fração em genes não codificadores (4,1%). Dentro dos transcritos codificadores de proteínas, os dados revelam que a maioria dos locais está situada na região da sequência codificante (CDS) (70,3%). A análise de motivos indica que a sequência característica para a 2'-O-metilação é AGAU, seguida por uma alta distribuição de bases A ou G. Além disso, os locais de 2'-O-metilação estão enriquecidos em códons codificadores de proteínas para três aminoácidos.

Figura 1: Características dos Locais de Metilação 2'-O-RNA em Moléculas de mRNA de Células Humanas.

Conclusão

Em resumo, este estudo revela, pela primeira vez, as características de distribuição da 2'-O-metilação em células humanas.

Estudo de Caso 2: Envolvimento da Metiltransferase de RNA 2'-O FTSJ3 na Regulação Imune Inata do HIV

Recentemente, o grupo de investigação liderado pela Professora Yamina Bennasser na Universidade de Montpellier, em França, descobriu, pela primeira vez, a presença de locais de 2'-O-metilação no vírus HIV. Estes locais exibem atividade na infeção das células hospedeiras e são regulados pela metiltransferase FTSJ3.

FTSJ3 como uma 2'-O-Metiltransferase:

Através de experimentos de espectrometria de massa e Western blot, foi observado que a proteína leitora de metilação TRBP interage com a metiltransferase FTSJ3, formando o complexo TRBP-FTSJ3.

Figura 2: Formação de Dois Complexos Distintos pelo TRBP.

Modificação de Metilação 2'-O em Partículas Virais de RNA do HIV-1:

Os investigadores utilizaram sequenciação de 2'-O-metilação para examinar o estado de metilação do RNA do HIV-1. Identificaram 17 locais de 2'-O-metilação, dos quais 15 estavam localizados na adenina. A sequenciação de metilação subsequente do HIV-1 embalado em células knockout de FTSJ3 revelou uma redução nos níveis de metilação em múltiplos locais. Isto indica a influência da metiltransferase FTSJ3 no padrão de 2'-O-metilação.

Figura 3: Perfil de Metilação do RNA do HIV-1 e o Impacto da Depleção de FTSJ3.

Envolvimento do FTSJ3 no Mecanismo de Regulação Imune do HIV-1:

Efeito na expressão de IFN-α/IFN-β: Em primeiro lugar, a FTSJ3 intracelular influencia a infeção das células hospedeiras pelo vírus? Os investigadores utilizaram células monocíticas U937 que expressam RNA do HIV, com knockdown de FTSJ3-siRNA ou tipo selvagem (WT). Os resultados revelaram um aumento significativo na expressão de IFN-α/IFN-β no grupo experimental em comparação com o grupo WT.

Figura 4: Envolvimento do FTSJ3 no Processo de Regulação Imune do HIV-1.

Regulação da MDA5 da Metiltransferase na Modulação Imune do HIV-1:

O MDA5, atuando como um sensor de RNA citoplasmático, desempenha um papel crucial na resposta imunitária. Após a redução do FTSJ3, houve uma diminuição na expressão de IFN. Subsequentemente, após a redução do MDA5, a expressão de IFN aumentou. Este resultado confirma que a metiltransferase contribui para a fuga da metilação 2'-O do RNA do HIV da deteção pelo MDA5, completando assim a evasão imunitária.

Figura 5: FTSJ3 Modula a Sensibilidade da Via MDA5-IFN.

A Depleção de FTSJ3 Suprime a Replicação do HIV:

Para avaliar o impacto do FTSJ3 na estimulação imune celular pelo vírus, os autores utilizaram a deleção do FTSJ3 em MDDCs durante a infecção viral. Claramente, as células knockout de FTSJ3 induziram a expressão da resposta antiviral do tipo I a partículas virais do HIV, inibindo simultaneamente a eficiência da expressão do HIV-1. Assim, o RNA não metilado siFTSJ3-HIV induz imunidade inata contra o RNA viral, suprimindo a replicação do HIV.

Figura 6: A depleção de FTSJ3 suprime a replicação do HIV.

Em resumo, este estudo revela, pela primeira vez, a atividade de 2'O-metilação de RNA da FTSJ3 e confirma que o vírus HIV pode recrutar o sistema FTSJ3-TRBP após a infeção para realizar modificações de 2'O-metilação no RNA viral. Consequentemente, esta modificação diminui a sensibilidade da via MDA5-IFN, reduzindo o reconhecimento pelo sistema imunitário. Este novo caminho de evasão imunitária inata do HIV-1 apresenta-se como uma nova alvo terapêutico promissor para o tratamento da SIDA.

Referências

1. Dai Q, Moshitch-Moshkovitz S, Han D, et al. Nm-seq mapeia locais de 2'-O-metilação em mRNA humano com precisão de base. Métodos da Natureza, 2017, 14(7): 695-698.
2. Ringeard, M., Marchand, V., Decroly, E. et al. FTSJ3 é uma RNA 2'-O-metiltransferase recrutada pelo HIV para evitar a deteção do sistema imunitário inato. Natureza, 2019, 565, 500–504.