oxBS-seq

A metilação e a hidroximetilação do DNA são modificações epigenéticas importantes para a regulação da expressão génica. A metilação do DNA tipicamente reprime a transcrição génica. A hidroximetilação, pelo contrário, ativa a expressão génica ou induz a desmetilação do DNA.

5-Hidroximetilcitosina (5hmC) é convertida a partir de 5-metilcitosina (5mC) por um grupo de enzimas denominadas dioxygenases da família ten-eleven translocation (TET). As tecnologias de conversão com bisulfito, que são o padrão-ouro para estudar a metilação do DNA, não distinguem entre 5mC e 5hmC. No entanto, novas abordagens para mapear 5hmC em todo o genoma avançaram rapidamente, embora não esteja claro como os diferentes métodos se comparam na identificação precisa de 5hmC.

A CD Genomics pode fornecer três abordagens de deteção em todo o genoma de 5hmC:

• Sequenciação de bisulfito/oxidativa de todo o genomaWGBS/WGoxBS-seq)
• Sequenciação de bisulfito oxidativo de bisulfito representativo reduzidoRRBS/RRoxBS)
• Imunoprecipitação baseada em anticorpos e sequenciação de DNA hidroximetiladohMeDIP-seq).
• Sequenciação de bisulfito/hidroximetilação de DNA direcionadaTBS/ oxTBS-seq)
• Tecnologia de rotulagem química seletiva de 5hmC (5hmC -Seal)

A Introdução do oxBS-seq

5-metilcitosina (5mC) pode ser oxidada por um grupo de oxigenases chamadas enzimas de translocação dez-onze (Tets). Sob consumo de oxigénio e 2-oxoglutarato, estas dioxigenases dependentes de Fe(II) oxidam 5mC numa primeira reação para 5-hidroximetilcitosina (5hmC), seguida de 5-formilcitosina (5fC) e, finalmente, 5-carboxicitosina (5caC). A forma mais abundante destas variantes de citosina oxidadas é 5hmC.

A conversão oxidativa de bisulfito (oxBS), uma reação de oxidação pré-bisulfito, converte 5hmC em 5fC, que será convertido pelo bisulfito em 5f-uracilo e em timina na PCR subsequente. Esta biblioteca é então comparada a uma biblioteca de sequenciação por bisulfito tradicional (BS-seq) construída na mesma amostra para determinar a quantidade de 5mC e 5hmC para cada citosina modificada dentro do DNA. A oxBS-seq tem um fluxo de trabalho experimental relativamente simples e rápido e pode obter simultaneamente tanto o metiloma quanto o hidroximetiloma.

Se quiser saber mais sobre a introdução do oxBS-seq, pode consultar o nosso artigo: "oxBS-Seq, um Método de Sequenciação Epigenética para Distinguir 5mC e 5hmC.

Figura 1. Diagrama Esquemático do Princípio do oxBS-seq. (Booth et al., 2013)

Quais são as Vantagens do oxBS-seq

• A resolução de nucleótido único abrange tanto a metilação CpG como a metilação não CpG em todo o genoma.
• A densidade de 5mC em regiões repetitivas e regiões de menor densidade está coberta.
• Os métodos distinguem claramente entre 5mC e 5hmC, permitindo a identificação precisa de 5mC.
• Estabelecimento de um Novo "Padrão Ouro" para a Detecção de Metilação de DNA
• Deteção de modificações de hidroximetilação de DNA em todo o genoma a nível de nucleótido único
• Validação multicritério para alta eficiência de oxidação e alta taxa de conversão de bisulfito
• O viés experimental é mínimo, com alta reprodutibilidade (R²>0,98)
• Satisfazer diversas necessidades de aplicação de sequenciação: Sequenciação de metilação de oxidação em todo o genoma simplificada (oxRRBS), Sequenciação de metilação de oxidação em regiões alvo (Target-oxBS)

Quais são as aplicações do oxBS-seq?

A nossa análise oxBS-seq apresenta aplicações versáteis em vários domínios de investigação:

• Epigenética: Facilitando investigações sobre a interação entre a metilação do DNA e a hidroximetilação em diversos cenários biológicos, a nossa análise oxBS-seq oferece uma compreensão subtil das modificações epigenéticas entrelaçadas com a regulação genética, a diferenciação celular e os caminhos de desenvolvimento.
• Pesquisa de Doenças: Através de uma meticulosa análise dos padrões de metilação e hidroximetilação do DNA em amostras de doenças, a nossa análise oxBS-seq revela alterações epigenéticas associadas a aflições como o câncer, distúrbios neurológicos e doenças cardiovasculares.
• Ambiental EpigenómicaAmplamente utilizado para analisar a influência de estímulos ambientais na dinâmica da metilação e hidroximetilação do DNA, a nossa análise oxBS-seq ajuda a discernir as alterações epigenéticas induzidas por diferentes exposições ambientais, elucidando assim as suas potenciais implicações na saúde e na suscetibilidade a doenças.
• Biologia do Desenvolvimento: Facilitando a exploração da dinâmica da metilação do DNA ao longo do desenvolvimento embrionário e dos processos de diferenciação tecidual, a nossa análise oxBS-seq fornece paisagens de metilação intrincadas a altas resoluções.

Fluxo de Trabalho de Sequenciamento oxBS-seq

O DNA genómico foi processado para obter fragmentos de 10 kb. O DNA fragmentado foi concentrado utilizando colunas de purificação. Este DNA fragmentado e purificado foi submetido a tratamento de oxidação + bisulfito. A troca de tampão, desnaturação, oxidação, conversão de bisulfito, limpeza e avaliação qualitativa da oxidação de 5-hidroximetilcitosina foram realizadas. Por fim, o DNA convertido em oxBS e BS foi utilizado para construir bibliotecas de oxBS-seq e as correspondentes bibliotecas de BS-seq. Todo o DNA de cadeia dupla e simples foi quantificado num Bioanalisador Agilent 2100 antes da geração de clusters e sequenciação na plataforma Illumina, de acordo com os protocolos do fabricante.

Figura 2. Esquemas dos passos para sequenciação de alto rendimento do repertório de sequências de Ig (Georgiou et al., 2014).

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra oxWGBS-Seq ADN Genómico ≥ 3µg, Quantidade Mínima: 1 µg, Concentração ≥ 30 ng/µL OxRRBS-Seq ADN Genómico ≥ 2µg, Concentração ≥ 50 ng/µL oxTBS-Seq DNA genómico ≥ 1µg, Concentração ≥ 20 ng/µL Quantidade inicial de DNA genómico ≥ 3 µg (5hmC Seal-seq), Concentração da amostra ≥ 50 ng/µl Todas as amostras de ADN são validadas quanto à pureza e quantidade. Para cfDNA, 15-40ng (5hmC Seal-seq)
	Sequenciação Illumina, PE150 WGBS+oxWGBS: >=30X RRBS+oxRRBS: 10G de dados) TBS+oxTBS: profundidade de sequenciação >= 200X hMeDIP-seq(IP+Input): >=20M leituras 5hmC Seal-seq(IP+Input): >=20M leituras Mais de 80% das bases com um escore de qualidade ≥Q30
	Análise Bioinformática Fornecemos análises de bioinformática personalizadas, incluindo: Controlo de Qualidade de Dados de Sequenciação Alinhamento em relação ao genoma de referência Distribuição dos níveis de metilação e hidroximetilação do genoma completo Análise de correlação análise PCA Análise de metilação diferencial e análise de hidroximetilação diferencial Anotação funcional com análise GO/KEGG Análise do nível de expressão diferencial de genes associados a picos

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em oxBS-seq para a sua escrita (personalização)

Referências:

1. Giehr, Pascal, Kyriakopoulos, et al. Dois são melhores do que um: HPoxBS - sequenciação de bisulfito oxidativo em forma de grampo. Pesquisa em ácidos nucleicos, 2018.
2. Skvortsova K, Zotenko E, Luu P L, et al. Avaliação abrangente das abordagens de perfilagem de 5-hidroximetilcitosina em todo o genoma no DNA humano. Epigenética e Cromatina, 2017, 10(1):16.
3. Booth M J, Ost T W B, Beraldi D, et al. Sequenciação de bisulfito oxidativo de 5-metilcitosina e 5-hidroximetilcitosina. Protocolos da Natureza, 2013, 8(10): 1841-1851.
4. Han Y, Ji L, Guan Y, et al. Uma paisagem epigenómica da neoplasia intraepitelial cervical e do câncer cervical utilizando metiloma e hidroximetiloma com resolução de base única. Medicina clínica e translacional, 2021, 11(7): e498.

(Han et al., 2021)

1. O que é oxBS-seq?

oxBS-seq é um sequenciação de alto rendimento técnica utilizada para medir a distribuição da metilação e hidroximetilação do DNA. Combina o tratamento com bisulfito oxidativo (oxBS) com análise de sequenciamento para distinguir 5mC e 5hmC com resolução de base única, fornecendo informações detalhadas sobre essas duas modificações no genoma.

2. Como é que o oxBS-seq difere do BS-seq tradicional?

A sequenciação BS tradicional (sequenciação por bisulfito) converte citosinas não metiladas (Cs) em uracilos (Us) enquanto preserva Cs metiladas. No entanto, 5hmC também é convertido em T pelo BS, tornando-o indistinguível de 5mC. Em contraste, a oxBS-seq oxida quimicamente 5hmC para C antes do tratamento com BS, permitindo a diferenciação entre 5mC e 5hmC.

3. Qual é o fluxo de trabalho do oxBS-seq?

O fluxo de trabalho oxBS-seq abrange várias etapas-chave: extração de DNA, tratamento de metilação oxidativa, tratamento com bisulfito (BS), sequenciação e análise de dados subsequente. Inicialmente, 5hmC é oxidado a C, seguido pelo tratamento BS para converter Cs não metilados em Ts, enquanto preserva 5mC e 5hmC. Subsequentemente, os dados de sequenciação são gerados e submetidos a uma análise abrangente utilizando ferramentas de bioinformática.

4. Quais são os métodos de análise para dados de oxBS-seq?

As rubricas analíticas aplicadas aos dados de oxBS-seq envolvem vários aspectos: pré-processamento, alinhamento, avaliação dos níveis de metilação e análise de modificação diferencial. A etapa de pré-processamento abrange as tarefas de controlo de qualidade e recorte de sequências. O alinhamento é uma tarefa que facilita a correspondência dos dados de sequenciação a um genoma de referência, permitindo a estimativa dos níveis de metilação em cada local e permitindo a diferenciação entre 5mC e 5hmC. Uma série de análises estatísticas subsequentes e interpretações biológicas são implementadas para trazer à luz conclusões pertinentes à questão de pesquisa central.

5. Como desenhar experimentos de oxBS-seq?

A estratégia de experimentos oxBS-seq exige a execução de certas tarefas, como a seleção de amostras, a elaboração do desenho experimental, a determinação da profundidade de sequenciação e a estratégia de análise de dados. Para abordar de forma holística uma variedade de questões de pesquisa, o experimentador pode ajustar os parâmetros do experimento, garantindo assim uma maior fiabilidade e precisão dos resultados experimentais. Além disso, é essencial que controles experimentais eficazes e réplicas sejam incorporados, servindo para apoiar a reprodutibilidade e a estabilidade das descobertas.

6. Quais são as limitações do oxBS-seq?

Embora o oxBS-seq apresente numerosas vantagens, não está isento de limitações. Por exemplo, um espectro de baixos níveis de metilação ou áreas de baixa complexidade genómica pode comprometer potencialmente a precisão da técnica. Além disso, o rigor técnico exigido pelos procedimentos experimentais e pela análise de dados subsequente pode trazer desafios consideráveis.

Mudanças na Metilação e Hidroximetilação de DNA em Todo o Genoma Revelaram a Regulação Epigenética da Neuromodulação e da Mielinização no Hipotálamo de Iaque

Revista: Frontiers in Genetics
Fator de impacto: 4,772
Publicado: 27 de setembro de 2021

Fundo

5-Metilcitosina (5mC) e 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) são modificações epigenéticas significativas que são parte integrante do processo de neurodesenvolvimento. No entanto, existem poucos estudos que identificam padrões em todo o genoma de 5mC e 5hmC em regiões cerebrais de animais como função de ambientes naturais de alta altitude.

Métodos

Resultados

RRBS e oxRRBS fornecem perfis de metilação e hidroximetilação com resolução de base única em 3,28 milhões de locais CpG, com oxRRBS a mostrar uma correlação mais elevada entre cadeias opostas. A menor consistência no RRBS pode ser devida à participação dinâmica de 5hmC na desmetilação do DNA. A análise focada em locais "verdadeiros" de 5hmC revelou diferenças específicas de tecido entre iaques e gado, particularmente no hipotálamo, cerebelo e tronco encefálico.

Fig 1. Metilação e hidroximetilação global de DNA entre as amostras.

O estudo elucidou padrões de distribuição distintos dos níveis de 5mC e 5hmC entre os genes, destacando diferenças significativas entre os tecidos, particularmente no hipotálamo. Comparações par a par entre os cérebros de iacos e gado revelaram regiões de metilação e hidroximetilação diferencial (DMRs e DhMRs), principalmente impulsionadas por alterações nos níveis de 5mC e 5hmC. A análise de enriquecimento dos termos de ontologia genética (GO) sublinhou mecanismos regulatórios específicos de tecido, particularmente em vias relacionadas com o sistema nervoso, sugerindo uma complexa regulação epigenética na função cerebral entre espécies.

Fig. 2. Identificação de DMRs e DhMRs em iacos e gado.

Conclusão

Este estudo utiliza técnicas de RRBS e RRBS oxidativa (oxRRBS) para descobrir variações significativas em 5mC e 5hmC presentes no hipotálamo e em outras regiões do cérebro de iacos e vacas. Isto inclui a identificação de regiões diferencialmente metiladas (DMRs) e regiões diferencialmente hidroximetiladas (DhMRs), com a maioria delas a sobrepor-se. Consequentemente, genes diferencialmente expressos (DEGs) potencialmente regulados por DMRs e DhMRs que podem desempenhar papéis cruciais na regulação neural e na formação de mielina foram validados. Em resumo, os resultados indicam que a regulação epigenética mediada por 5mC e 5hmC pode impactar extensivamente o desenvolvimento e as funções biológicas do hipotálamo, possivelmente contribuindo para a melhoria da adaptabilidade fisiológica em condições de alta altitude.

Referência:

1. Chai Z, Wu Z, Ji Q, et al. Alterações de metilação e hidroximetilação de DNA em todo o genoma revelaram a regulação epigenética da neuromodulação e mielinização no hipotálamo de iacos. Fronteiras em Genética, 2021, 12: 592135.