oxBS-Seq, um Método de Sequenciação Epigenética para Distinguir 5mC e 5mhC

Para distinguir entre 5-metilcitosina (5mC) e 5-hidroximetilcitosina (5hmC), sequenciação por bisulfito oxidativo (oxBS-Seq)) fornece uma etapa oxidativa extra ao bisulfito. Inicialmente, 5hmC é oxidado no DNA genómico a 5-formilcitosina (5fC). Ao contrário de 5mC e 5hmC, 5fC é sensível à desaminação por bisulfito, portanto, o tratamento do DNA oxidado com bisulfito transforma 5fC em uracilo. As citosinas restantes na sequência eram 5mC e não 5hmC, utilizando sequenciação de próxima geração. A identificação paralela de 5mC e 5hmC é realizada em uma corrida padrão de bisulfito. A participação de 5hmC pode ser deduzida ao contrastar essas duas sequências. A principal vantagem do oxBS-Seq sobre métodos enzimáticos, como o TAB-seq, é que o oxBS-Seq não envolve uma enzima TET altamente engajada, que pode ser dispendiosa e apenas cerca de 95% eficaz.

Figura 1. Sequenciação quantitativa de 5-formilcitosina no DNA com resolução de base única. (Booth, 2014)

Vantagens e Desvantagens da Sequenciação por Bisulfito Oxidativo

Existem três principais benefícios do oxBS-Seq. Estes envolvem (1) metilação de CpG e não-CpG com resolução de base única em todo o genoma, (2) cobertura de 5mC em áreas de repetições densas e menos espessas, e (3) distinguir claramente entre 5mC e 5hmC.

Mas o oxBS-Seq também tem as suas desvantagens. As suas duas desvantagens existentes são (1) perda significativa de DNA (99,5 por cento) que pode resultar de circunstâncias de oxidação severa, e (2) deve ser integrado com sequenciação por bisulfito (BS-Seq) diferenciar e avaliar C, 5mC e 5hmC.

Princípios do oxBS-Seq

5mC é um símbolo epigenético do DNA que é potenciado com dinucleotídeos CpG e desempenha um papel essencial no silenciamento de genes e na fiabilidade do genoma. 5mC é uma marca epigenética popular com mecanismos significativos no crescimento, transposão e silenciamento de genes, impressão genética, inibição dos cromossomas X e sustentabilidade do genoma. Em muitas doenças humanas, como o câncer, em que a hipometilação grossa é seguida por hipermetilação dentro de certas ilhas CpG, a metilação anormal do DNA tem estado envolvida.

A família de enzimas de translocação dez-onze (TET) pode oxidar 5mC em 5hmC. Na desmetilação ativa do DNA, 5hmC pode ser uma alternativa, mas também pode envolver uma marca epigenética em si. Através de técnicas analíticas, as taxas de 5hmC no DNA genómico podem ser calculadas e plotadas através do aumento das porções de DNA que contêm 5hmC, que são então sequenciadas. Esses métodos têm uma resolução comparativamente baixa e fornecem apenas informações quantificáveis relativas. Usando BS-Seq, a sequenciação de nucleotídeos únicos de 5mC foi realizada, mas 5mC de 5hmC não pode ser discriminado por esta técnica. O 5hmC derivatizado no DNA genómico pode ser detectado por sequenciação em tempo real de moléculas únicas (SMRT). No entanto, a melhoria dos fragmentos de DNA que envolvem 5hmC é necessária, causando a falha dos dados quantitativos. Além disso, o SMRT tem uma taxa de erros de sequenciação significativamente alta, e a modificação da chamada de picos é imprecisa. O 5mC de 5hmC pode ser resolvido por proteínas e estado sólido. nanoporos e pode sequenciar DNA não amplificado.

Através da oxidação química extremamente seletiva de 5hmC a 5fC, o oxBS-Seq distingue entre 5mC e 5hmC. O método também utiliza a distinção de reatividade do bisulfito entre 5hmC e 5fC. O tratamento com bisulfito faz com que 5fC seja deformilado e desaminado para estabelecer uracilo (que é lido como timina na fase de sequenciação), ao contrário de 5hmC, que não se desamina. Assim, após o oxBS-seq, a única base que não é desaminada e, portanto, lida como citosina é 5mC. Correspondentemente, esta estratégia fornece uma visão geral fiável de todo o 5mC atual. Ao realizar BS-seq e avaliar os seus resultados com os do oxBS-seq, a identificação subsequente de 5hmC é alcançada.

Aplicações e Progresso da Pesquisa

Juntamente com uma multitude de técnicas analíticas que já foram estabelecidas para BS-seq, como sequenciação de DNA e arrays de metilação, o processo oxBS-seq pode ser utilizado para alterar o DNA. Esta técnica é independente de sistema quando utilizada em conjunto com sequenciação de nova geração e é adequada para a avaliação de 5mC e 5hmC com resolução de base única em plataformas de genoma completo ou regiões-alvo. O oxBS-seq é compatível com métodos de melhoria e direcionamento, como PCR específica de locus pós-bisulfito e representação reduzida de BS-seq, além da avaliação de genoma completo.

Referências:

1. Kirschner K, Krueger F, Green AR, Chandra T. Multiplexação para Sequenciação de Bisulfito Oxidativo (oxBS-seq). In Protocolos de Metilação de DNA 2018. Humana Press.
2. Ecsedi S, Rodríguez-Aguilera JR, Hernandez-Vargas H. 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), ou como identificar a sua célula favorita. Epigenomas. 2018, 2(1).
3. Booth MJ, Marsico G, Bachman M, et al.Sequenciação quantitativa de 5-formilcitosina em DNA com resolução de base única. Química da Natureza. 2014, 6(5):435.
4. Booth MJ, Branco MR, Ficz G, et al.Balasubramanian S. Sequenciação quantitativa de 5-metilcitosina e 5-hidroximetilcitosina com resolução de base única. Ciência. 2012.
5. Schüler P, Miller AK. Sequenciação da Sexta Base (5‐Hidroximetilcitosina): A Oxidação Seletiva de DNA Permite a Resolução de Pares de Bases. Angewandte Chemie Edição Internacional. 2012, 51(43).