Sequenciação de Região Alvo

A CD Genomics tem fornecido serviços de sequenciação de regiões alvo rápidos e acessíveis durante décadas. Utilizamos instrumentos de sequenciação de última geração para ajudá-lo a obter informações completas de DNA dos alvos selecionados de forma económica, o que pode aumentar significativamente tanto a amplitude como a profundidade da sua investigação em genómica.

A Introdução do Sequenciamento de Região Alvo

A sequenciação de regiões direcionadas é uma abordagem eficaz para investigar as suas regiões de interesse selecionadas através de sequenciação de próxima geração. Ao utilizar painéis de sequenciação de regiões direcionadas, pode descobrir polimorfismos de nucleótido único (SNPs), inserções/deleções (InDels), variações no número de cópias (CNVs) e variantes estruturais (SVs). Comparado com sequenciação do genoma completoA sequenciação de regiões alvo permite a deteção precisa de variantes raras com maior sensibilidade e especificidade. Esta abordagem é muito rentável ao lidar com um grande número de amostras, o que reduz significativamente o custo por amostra.

O processo de sequenciação de regiões alvo inclui o design/síntese de sondas/primas, captura das regiões alvo, construção da biblioteca, sequenciação de extremidades pareadas e análise bioinformática com base nas sequências alvo. Conjuntos específicos de sondas/primas são projetados para enriquecer as regiões alvo utilizando métodos de hibridação ou amplificação. No método de captura por hibridação, sondas oligonucleotídicas biotiniladas são projetadas para direcionar regiões de interesse dentro de uma biblioteca de fragmentos de DNA. Após uma incubação de hibridação, esferas magnéticas revestidas com estreptavidina são usadas para capturar os híbridos de sonda biotinilada/alvo, resultando em uma biblioteca que é altamente enriquecida para o DNA alvo. O método de amplificação atual baseia-se em PCR multiplex ou alguma forma de extensão de primers através das regiões de interesse.

O sequenciamento de regiões alvo tem uma ampla gama de aplicações, incluindo:

• Deteção de SNPs/InDels/CNVs/SVs
• Descoberta de mutações germinativas ou somáticas
• Deteção e quantificação de variantes raras e alelos de baixa frequência
• Análise de ligação para doenças hereditárias
• Descoberta de biomarcadores e alvos terapêuticos

Vantagens da Sequenciação de Região Alvo

• Identificação de variantes com baixas frequências alélicas (até 1%).
• Um conjunto de dados menor para análise bioinformática.
• Custo muito mais baixo com um grande número de amostras.
• Alta profundidade (500-1000X, ou superior), permitindo a identificação de variantes raras.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Região Alvo

A CD Genomics utiliza instrumentos Illumina HiSeq para fornecer sequenciação de regiões alvo rápida e precisa, bem como análise bioinformática. Os nossos especialistas altamente experientes executam a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados de alta qualidade. O fluxo de trabalho geral para a sequenciação de regiões alvo está delineado abaixo.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Quantidade de DNA ≥ 10 ng, concentração de DNA ≥ 1 ng/μl, OD260/280=1.8~2.0. Todas as amostras de ADN são validadas quanto à pureza e quantidade. Nota: Os montantes de amostra são indicados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciamento HiSeq plataformas PE150, MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400. Profundidade de cobertura ≥ 100x; ≥ 500x é recomendada para amostras de cancro. Mais de 80% das bases com um score de qualidade ≥Q30.
	Análise Bioinformática Fornecemos análises de bioinformática personalizadas, incluindo: Controlo de qualidade de dados brutos Filtragem e alinhamento Chamada e anotação de SNP/InDel/CNV/SV Análise de mutações somáticas em câncer Análise de doenças complexas Análise de doenças mendelianas De novo análise de mutações para amostras familiares Anotação DMR e análise de enriquecimento (GO/KEGG) Mais análises a seu pedido. Nota: Os dados de saída recomendados e os conteúdos de análise exibidos são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de Região Alvo para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece um pacote completo de serviços de sequenciação de regiões alvo, incluindo padronização de amostras, design de sondas/primas, captura direcionada, construção de bibliotecas, sequenciação profunda, controlo de qualidade de dados brutos e análise bioinformática. Podemos personalizar este fluxo de trabalho de acordo com o seu interesse de pesquisa. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

1. Qual é a diferença entre sequenciação do exoma completo e sequenciação de regiões alvo?

Apesar do provavelmente mesmo princípio e fluxo de trabalho, sequenciação do exoma completo foca no exoma enquanto o sequenciamento de regiões alvo se concentra em quaisquer genes que você definir.

2. O que preciso de submeter?

O cliente que requer o serviço da região alvo deve submeter as amostras de DNA ou tecido, bem como a lista de candidatos a genes ou a localização cromossómica da sua região alvo. Nós somos responsáveis pela geração de sondas, enriquecimento do alvo, construção de bibliotecas, sequenciação e análise bioinformática.

Aceitamos os seguintes tipos de amostras para sequenciação de regiões alvo: DNA genómico purificado, amplicons de PCR, pellets celulares congelados, colónias bacterianas, secções de tecido FFPE (fixadas em formalina e embebidas em parafina), tecidos, sangue e swabs.

3. E quanto ao tempo de resposta?

A sequenciação de regiões alvo requer sondas feitas sob medida, e a sonda feita sob medida necessita de uma otimização adicional para uma enriquecimento eficaz das regiões alvo. Muitas vezes, leva 40 dias úteis para concluir a personalização das sondas e a sequenciação profunda. No entanto, existem soluções comerciais para a sequenciação de regiões alvo, como as Sondas SeqCap EZ Prime Choice, que podem eliminar o processo de personalização das sondas.

4. Como validar variantes?

Variantes identificadas através do sequenciação de nova geração (NGS) requerem confirmação adicional usando NGS ou Sequenciação de SangerDe acordo com a pesquisa realizada por Coppieters em setembro de 2014, quase 70% dos 178 respondentes indicaram que estão atualmente a validar as suas descobertas de NGS utilizando NGS ou sequenciação Sanger. Nós iremos validar variantes utilizando NGS e sequenciação Sanger.

Figura 1. Um inquérito sobre os métodos de confirmação de variantes (Coppieters et al. 2016).

Referência:

1. Coppieters F, Verniers K, De Leeneer K, et al. Re-sequenciamento direcionado e validação de variantes usando ensaios de PCR pxlence. Deteção e quantificação biomolecular, 2016, 6: 22-26.

Identificação de uma nova mutação missense de MIP numa família chinesa com cataratas congénitas através de sequenciação por captura de região alvo
Revista: Scientific Reports
Fator de impacto: 4,259
Publicado: 06 de Janeiro de 2017

Resumo

Os autores recrutaram uma família chinesa com cataratas congénitas autossómicas dominantes (CCAD). Encontraram uma mutação missense heterozigótica c.634G>C (p.G212R) de substituição no MIP gene utilizando sequenciação da região alvo. Em conclusão, o estudo apresentou evidências genéticas e funcionais para esta nova mutação, que leva a uma pontuação cortical progressiva congénita com ou sem sutura em Y. O probando (II:2) tinha um tipo diferente de

Resultados

1. Características clínicas

Os autores investigaram uma família chinesa (Figura 1) e descobriram que o probando (II:2) apresentava uma catarata pontilhada, enquanto os outros membros afetados mostravam opacidades corticais pontilhadas, combinadas com cataratas em Y. (Figura 2).

Figura 1. Pedigree da família. Quadrados e círculos denotam homens e mulheres, respetivamente. Símbolos pretos denotam membros afetados, enquanto símbolos abertos denotam indivíduos não afetados. A linha diagonal denota um membro da família falecido, e a seta preta denota o probando. Asteriscos denotam indivíduos sequenciados.

Figura 2. Fotografias com lâmpada de fenda dos pacientes. O probando II:2 (A) apresentou uma catarata punctata, enquanto o seu irmão mais novo II:6 (B) e o filho do irmão III:5 (C) apresentaram cataratas em Y combinadas com opacidades corticais punctatas.

2. Sequenciação da região-alvo e análise de variantes

Um painel de captura feito sob medida foi projetado para capturar 351 genes de doenças oculares genéticas que foram coletados do OMIM (Conhecimento em Genética Humana para o Mundo) e da literatura publicada. Os autores encontraram quatro variantes raras em ambas as amostras (Tabela 1).

Tabela 1. Variantes raras em genes causadores de catarata congénita.

mutação 3. c.634G>C

Apenas a mutação c.634G>C do MIP o gene era uma nova mutação missense heterozigótica, que alterou Glicina para Arginina na posição 212 (p.G212R). A análise de segregação revelou que a mutação co-segregou bem com todos os participantes afetados e não foi detectada em membros não afetados ou nos 100 controles normais.

A análise do PolyPhen-2 e SIFT indicou fortemente que a mutação p.G212R é provavelmente prejudicial à proteína e pode ser responsável pelas cataratas congénitas. Um alinhamento múltiplo de sequências mostrou que a Glicina na posição 212 de MIP é altamente conservado entre várias espécies (Figura 3B).

Figura 3. análise de mutações do MIP gene.

níveis de mRNA e proteína de WT-MIP e G212R-MIP

Os autores investigaram a expressão do tipo selvagem. MIP e G212R-MIP em células HeLa transfectadas. Mostrou que a fluorescência verde nas células HeLa transfectadas com o constructo G212R era muito mais fraca do que nas transfectadas com o constructo de tipo selvagem.

A RT-PCR foi utilizada para medir o nível de transcrição de RNA do WT-MIP e G212R-MIP, que revelou que um parente semelhante MIP níveis de expressão de mRNA (Figura 4B). No entanto, o Western blot indicou que os níveis de expressão da proteína de MIP foram significativamente reduzidos no G212R-MIP células (Figura 4C) em conformidade com os resultados da análise de microscopia de fluorescência.

Figura 4. Níveis de mRNA e proteína de WT-MIP e G212R-MIP.

Conclusões

No presente estudo, os autores sugerem que a substituição c.634G>C, G212R pode contribuir para a patogénese da ADCC nesta família chinesa.

A sequenciação de regiões alvo é uma ferramenta poderosa para o diagnóstico clínico de um grupo heterogéneo de distúrbios monogénicos devido ao desempenho compatível na cobertura de captura, ao custo mais baixo e ao tempo de resposta mais curto.