Diretrizes para Submissão de Amostras
O que é Polysome-Seq?
Na biologia molecular moderna, a pesquisa sobre a expressão génica foi muito além da simples quantificação dos níveis de mRNA. O processo de tradução—onde os ribossomas decodificam os modelos de mRNA em proteínas—representa mais de metade de todos os eventos regulatórios génicos, exercendo uma influência profunda no comportamento celular, na função das proteínas e no desenvolvimento de doenças. No entanto, os métodos transcriptómicos tradicionais muitas vezes não conseguem revelar o verdadeiro panorama da síntese de proteínas, criando lacunas entre a abundância de mRNA medida e a produção real de proteínas.
Sequenciação de polissomos (Polysome-seq) preenche esta lacuna crítica. Ao combinar a perfuração de polissomos com sequenciação de alto débito, o Polysome-seq oferece aos investigadores uma visão abrangente e quantitativa de como os ribossomos interagem com milhares de mRNAs em diversas condições biológicas. Revela insights dinâmicos sobre a regulação da tradução, permitindo uma exploração precisa da expressão génica ao nível onde as proteínas—os efetores finais da função celular—são realmente produzidas.Como Funciona o Perfilamento de Polissomos
A perfuração de polissomos é um método analítico que separa o RNA citoplasmático com base no número de ribossomas ligados a cada molécula de mRNA. Utilizando a ultracentrifugação em gradiente de sacarose, os lisados celulares são fracionados em camadas distintas que representam:
- mRNA livre (não envolvido na tradução)
- Subunidades ribossómicas 40S e 60S
- monossomas 80S (ribossomas únicos)
- Polissomas leves e pesados (múltiplos ribossomas a traduzir um único mRNA)
Uma Comparação das Tecnologias de Ómicas Translacionais
A investigação translacional expandiu-se para incluir várias tecnologias de alta resolução, cada uma oferecendo perspetivas únicas:
| Tecnologia | Foco Principal | Vantagens Principais | Limitações |
|---|---|---|---|
| Perfilagem de Polissomos / Polissomo-seq | Mede a ocupação dos ribossomas para inferir a eficiência da tradução. | - Medição da eficiência da tradução direta - Retém fragmentos de RNA mais longos para análise posterior |
- É necessária uma amostra de entrada maior. - Sem dados de posição de ribossomas |
| Ribo-seq (Perfilagem de Ribossomas) | Mapeia posições precisas de ribossomas no mRNA com resolução de códon. | - Detecta locais de início, ORFs, uORFs - Revela pausas e dinâmicas de tradução |
- Tecnicamente complexo - Não é possível distinguir ribossomas ativos de ribossomas parados. |
| RNC-seq (Sequenciação de Complexos Ribossoma-Cadeia Nascente) | Captura mRNAs de comprimento total ligadas a ribossomas. | - Preserva toda a estrutura do mRNA - Detecta isoformas de splicing alternativo |
- Falta informação posicional dos ribossomas - Resolução inferior da dinâmica de tradução |
| Disome-seq | Detecta colisões de ribossomas e pausas na tradução. | - Ilumina eventos regulatórios co-traduzionais | - Técnica especializada e mais recente com menos aplicações |
| TRAP-seq | Isola mRNAs ligados a ribossomas em tipos celulares específicos através de ribossomas marcados. | - Perfilagem de tradução específica de células ou tecidos | - Requer modelos transgénicos - Possível interferência na função do ribossoma |
Entre estas tecnologias, Polysome-seq destaca-se como um compromisso ideal—preserva a integridade do RNA, revela a eficiência de tradução em todo o transcriptoma e permite uma análise integrativa juntamente com transcriptómica, epitranscriptómica e proteómica.
Oferecemos um conjunto completo de serviços de perfilagem translacional, incluindo Polysome-seq, Ribo-seq, RNC-seq, Disome-seq e TRAP-seq, para atender às diversas necessidades de investigação em todas as áreas da biologia molecular..
O Nosso Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Polissomas: Da Amostra ao Conhecimento
1. Consulta e Design Experimental
Cada projeto começa com uma discussão detalhada entre a nossa equipa científica e o seu grupo de pesquisa para:
- Defina as suas questões biológicas e hipóteses.
- Selecione condições experimentais apropriadas, controlos e repetições.
- Escolha entre estratégias de sequenciação de polissomos de fração única ou múltiplas frações.
- Alinhe o seu projeto com os padrões de qualidade de publicação.
2. Preparação de Amostras e Estabilização de Ribossomas
- Células ou tecidos são colhidos e tratados com inibidores da elongação da tradução (por exemplo, ciclopetidina) para congelar os ribossomas no lugar.
- O processamento rápido em condições livres de RNase preserva os complexos ribossoma-mRNA e previne a degradação.
3. Perfis de Polissomos através de Ultracentrifugação em Gradiente de Sacarose
- Os extratos citoplasmáticos são sobrepostos a um gradiente linear de sacarose (tipicamente 10-50%).
- A ultracentrifugação separa complexos de mRNA-ribossoma com base na densidade, produzindo frações que distinguem.
- A perfuração de absorção UV define precisamente os picos correspondentes a cada fração.
4. Coleta de Frações e Extração de RNA
As frações de gradiente individuais são coletadas, seja:
- Como uma única "fração de polissomos agrupados" (para uma caracterização global económica).
- Ou como múltiplas frações (polissomas leves vs. pesados) para uma resolução mais profunda das mudanças na tradução.
- O RNA é extraído de cada fração, garantindo alta integridade para sequenciação posterior.
5. Preparação de Bibliotecas e Sequenciação de Nova Geração
O RNA sofre:
- depleção de rRNA ou seleção de poli-A (dependendo dos objetivos do estudo).
- Fragmentação e ligação de adaptadores.
- Transcrição reversa e amplificação de biblioteca.
Análise Bioinformática e Interpretação de Dados
Excelência em Bioinformática
- Controlo de qualidade rigoroso e filtragem
- Alinhamento a genomas ou transcriptomas de referência
- Quantificação de transcritos através de frações
- Cálculo da Eficiência de Tradução (ET)
- Análise de tradução diferencial entre condições
- Integração com:
- RNA-seq
- Epitranscriptómica (por exemplo, m6A, m7G)
- Proteómica
Os entregáveis incluem:
- Gráficos e figuras prontos para publicação
- Relatórios estatísticos abrangentes
- Interpretação especializada adaptada aos seus objetivos de estudo
Requisitos de Amostra
| Tipo de Amostra | Montante Mínimo | Notas |
|---|---|---|
| Linhas celulares de mamíferos | ≥ 4 × 10⁷ células | Cultivado em condições padrão; evitar a sobreconfluência. |
| Tecidos animais | ≥ 400 mg | Congelar imediatamente após a dissecação. |
| Tecidos vegetais | ≥ 400 mg | Remova o excesso de água antes de congelar. |
| Culturas bacterianas | ≥ 4 × 10⁷ células | Colha durante a fase logar para uma atividade ribossómica otimizada. |
| Culturas fúngicas | ≥ 4 × 10⁷ células | Assegure uma homogeneização adequada antes da lise. |
| Complexos de ribossomas isolados | Variável; inquirir | Protocolos personalizados disponíveis para projetos especializados. |
Diretrizes para Manuseio de Amostras
- Congele rapidamente as amostras em azoto líquido imediatamente após a colheita.
- Armazenar a -80°C até ao envio.
- Envie em gelo seco para manter a integridade do RNA.
- Identifique claramente todos os tubos e forneça uma ficha de amostra detalhada.
- Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
O que Você Receberá do Nosso Serviço de Sequenciação de Polissomos
- Ficheiros FASTQ brutos de sequenciação de alto débito.
- Ficheiros de alinhamento BAM mapeados para genomas ou transcriptomas de referência.
- Dados de expressão génica quantificados em frações de polissomas.
- Cálculos de Eficiência de Tradução (TE) para cada transcrição.
- Listas de genes que mostram tradução diferencial entre condições.
- Gráficos de perfil de polissomos ilustrando a ocupação dos ribossomas.
- Gráficos de vulcão e mapas de calor para visualizar alterações na tradução.
- Integração multi-ômica opcional com RNA-seq, epitranscriptómica ou proteómica.
- Um relatório técnico abrangente com métodos, resultados e interpretações.
- Acesso direto aos nossos cientistas para revisão de dados e discussões de projetos.
Por que escolher o nosso serviço de sequenciação de polissomos?
Insights de Tradução Inigualáveis
- Vá além da abundância de mRNA para ver como os genes são verdadeiramente expressos ao nível da síntese de proteínas.
- Capture as dinâmicas globais de tradução e identifique os estrangulamentos regulatórios em doenças, respostas ao stress e processos de desenvolvimento.
Flexibilidade para Objetivos de Pesquisa Diversificados
- Opções de fração única ou multi-fração para uma profundidade de análise personalizada.
- Compatível com uma ampla gama de organismos, desde células mamíferas a plantas e micróbios.
- Protocolos de ultra-baixo consumo disponíveis para amostras preciosas ou limitadas.
Integração Multi-Ómica Sem Costura
Integrar dados de polissomos com:
- Transcriptómica (RNA-seq)
- Epitranscriptómica (por exemplo, modificações m6A, m7G)
- Proteómica
- Obtenha uma visão holística da regulação da expressão génica.
Entregáveis Prontos para Publicação
- Figuras de alta qualidade e análises estatísticas elaboradas para revistas científicas.
- Documentação clara e seções de métodos adequadas para inclusão no manuscrito.
Apoio Científico Especializado
- Acesso direto a cientistas de nível de doutoramento com vasta experiência em investigação translacional.
- Orientação personalizada desde o design experimental até à interpretação de dados.
- Tempos de resposta rápidos para manter o seu projeto em andamento.
Historial Comprovado
- Apoiado centenas de publicações em revistas com revisão por pares.
- Confiado por investigadores em todo o mundo na academia, farmacêutica e biotecnologia.
Aplicações da Sequenciação de Polissomas
Investigação do Cancro – Descubra a reprogramação translacional que impulsiona a progressão tumoral e a resistência à terapia.
Estudos sobre Modificações de RNA – Descubra como o m6A, m7G e outras modificações influenciam a eficiência da tradução.
Neurobiologia – Investigar o controlo translacional no desenvolvimento neural, plasticidade e doenças neurodegenerativas.
Ciência das Plantas – Estudar as respostas ao stress, o desenvolvimento e as características de rendimento a nível translacional em culturas.
Pesquisa Metabólica – Examine as mudanças de tradução durante distúrbios metabólicos e a deteção de nutrientes.
Diferenciação de Células-Tronco – Explorar paisagens de tradução que orientam decisões sobre o destino celular.
Fisiologia Microbiana – Analisar a regulação da tradução em bactérias e fungos sob alterações ambientais.
Tradução de RNA Não Codificante – Detetar péptidos ocultos de lncRNAs, circRNAs e outros ncRNAs.
Mecanismos de Resposta ao Stress – Perfil das alterações globais de tradução sob choque térmico, stress oxidativo ou hipoxia.
Estudos de Mecanismo de Ação de Fármacos – Avaliar como os compostos terapêuticos impactam a eficiência de tradução e o envolvimento do ribossoma.
Resultados da Demonstração
Perguntas Frequentes sobre Polysome Seq
1. O que é o Polysome-Seq e como funciona?
Polysome-Seq combina a profilagem de polissomas com a sequenciação de RNA para avaliar o estado de tradução em todo o transcriptoma—separando frações associadas a ribossomas leves e pesados e quantificando o seu conteúdo de mRNA para análise da eficiência de tradução.
2. Como é que o Polysome-Seq difere do Ribo-seq?
Polysome-Seq perfila o número de ribossomas em cada mRNA, oferecendo uma visão da tradução global. Em contraste, Ribo-seq mapeia as posições das pegadas dos ribossomas com resolução de códon — ideal para detectar locais de início, uORFs e tradução pausada.
3. O Polysome-Seq consegue detetar a tradução de RNAs não codificantes?
Sim. Ao sequenciar fragmentos de mRNA mais longos a partir de frações de polissomos, o Polysome-Seq pode capturar lncRNAs, circRNAs e outros ncRNAs que estão a ser traduzidos ativamente, revelando peptídeos ocultos.
4. Quais tipos de amostras são compatíveis com Polysome‑Seq?
Amostras comuns incluem células cultivadas, tecidos de animais ou plantas, bactérias, fungos e até complexos de ribossomas purificados. O manuseio adequado das amostras e a estabilização dos ribossomas são essenciais.
5. É necessário equipamento especializado?
Sim. A profilagem de polissomas depende de ultracentrifugação, fracionamento em gradiente e deteção por UV. Estes passos exigem experiência técnica e reagentes de alta qualidade—exatamente o que a nossa equipa fornece.
6. Quais análises de bioinformática estão incluídas?
O nosso pipeline inclui QC de dados, alinhamento de genoma/transcriptoma, quantificação de transcritos, cálculo de TE, análise de tradução diferencial e visualizações. A integração com RNA-seq, epitranscriptómica ou proteómica também está disponível para um perfil de tradução abrangente.
7. Quais são as limitações do Polysome-Seq?
Os desafios potenciais incluem requisitos de grandes amostras de entrada e uma eficiência moderada de recuperação de RNA. Além disso, os dados de ribossoma posicionais não são fornecidos—ao contrário do Ribo-seq.
8. Podem o Polysome‑Seq e o Ribo‑seq ser usados em conjunto?
Absolutamente. A combinação de ambos proporciona uma visão holística: o Polysome-Seq revela o envolvimento translacional, enquanto o Ribo-seq oferece detalhes sobre a posição dos ribossomas e eventos de tradução não canónicos.
9. Como é interpretado o perfil de dados de polissomos?
Os perfis exibem a distribuição de ribossomas ao longo do mRNA através de picos de absorção UV. A razão entre polissomas e monossomas indica a atividade translacional. O sequenciamento subsequente permite uma análise quantitativa da eficiência de tradução.
10. Que medidas de controlo de qualidade estão implementadas?
Implementamos verificações rigorosas em cada etapa—reproduzibilidade do perfil UV, integridade do RNA (pontuação RIN), métricas de qualidade da biblioteca e controlo de qualidade bioinformático. Estes garantem resultados fiáveis e de alto impacto.
Estudos de Caso de Polissomos Seq
Título: METTL5 estabiliza o c-Myc ao facilitar a tradução da USP5 para reprogramar o metabolismo da glicose e promover a progressão do carcinoma hepatocelular.
Fonte: Xia et al., Comunicações sobre o Cancro, 2023
Fator de Impacto: 20.1
Contexto do Estudo
- METTL5 é uma metiltransferase de rRNA 18S.
- Os cientistas suspeitavam que o METTL5 poderia promover o câncer ao afetar a forma como certos mRNAs são traduzidos em proteínas.
- O foco estava no c-Myc, um oncogene crítico, e na USP5, uma deubiquitinase que estabiliza o c-Myc.
Principais Questões de Pesquisa
- O METTL5 afeta os níveis da proteína c-Myc através da regulação da tradução?
- Como é que isto influencia o metabolismo das células cancerígenas?
Métodos Utilizados
✅ Perfilagem de Polissomas + RNA-Seq
- mRNAs separados em frações com base na carga de ribossomas.
- mRNAs ligados a polissomas sequenciados para avaliar a eficiência de tradução.
✅ qRT-PCR e Western Blot
- Alterações verificadas nos níveis de RNA e nos níveis de proteína.
✅ Associação ChIP e Metabolómica
- Explorou mecanismos regulatórios e mudanças metabólicas.
✅ Xenotransplantes Derivados de Pacientes (PDX)
- Resultados validados em modelos tumorais animais.
Principais Conclusões
- METTL5 regula em alta a tradução do mRNA USP5, resultando em níveis mais elevados da proteína USP5.
- USP5 estabiliza a proteína c-Myc ao reduzir a sua degradação.
- O c-Myc elevado impulsiona o aumento da expressão de genes glicolíticos (por exemplo, LDHA, ENO1).
- A redução de METTL5 leva a um crescimento tumoral reduzido em ratos.
Impacto da Sequenciação de Polissomas
A sequenciação de polissomas foi crítica porque:
- O RNA-seq padrão por si só não revelaria um aumento na eficiência de tradução da USP5.
- Apenas ao analisar frações carregadas de ribossomas é que os investigadores detectaram como a METTL5 aumenta a produção de USP5.
- Ajudou a ligar a metilação do RNA (através da METTL5) ao reprogramação metabólica—uma característica chave do câncer.
USP5 é a enzima desubiquitinante para c-Myc.
Por Que É Importante
✅ Polysome-seq revela a regulação da tradução invisível apenas à transcriptómica.
✅ Permite a descoberta de alvos terapêuticos como o METTL5.
✅ Mostra um impacto real em contextos de doenças, desde mecanismos moleculares até resultados tumorais.
