Genotipagem de SNP TaqMan

A CD Genomics oferece ensaios Taqman personalizados para realizar Genotipagem de SNPs, permitindo a identificação e amplificação de polimorfismos.

A Introdução da Genotipagem de SNP TaqMan

TaqMan é um método comumente utilizado Genotipagem de SNPs método desenvolvido pela Life Technologies. É uma tecnologia avançada, madura, validada e amplamente utilizada. O ensaio de genotipagem SNP TaqMan também é chamado de "ensaio de discriminação alélica por 50-nuclease". Cada ensaio de genotipagem TaqMan contém dois primers para amplificar a sequência de interesse e duas sondas TaqMan de ligação ao sulco menor (MGB) específicas para alelos e rotuladas de forma diferente para a deteção de alelos. Cada sonda MGB específica para alelos é rotulada com um corante fluorescente (seja uma molécula de reporter FAM ou VIC) na extremidade 5' e está ligada a um quencher de fluorescência na extremidade 3'. Enquanto a sonda estiver intacta, a proximidade do corante quencher ao corante reporter suprime a fluorescência do reporter. Durante a etapa de amplificação PCR, se a sonda específica para o alelo for perfeitamente complementar ao alelo SNP, ela irá hibridizar ao segmento de DNA alvo e, em seguida, ser degradada pela atividade 5'-nuclease da Taq polimerase. A degradação da sonda resulta na separação do fluoróforo da molécula quencher, gerando um sinal fluorescente detectável. Se houver uma única discrepância pontual entre a sonda e a cadeia de DNA alvo devido a um SNP, a ligação da sonda ao DNA é desestabilizada durante o deslocamento de cadeia na PCR, o que reduzirá a eficiência da clivagem da sonda e do apagamento do corante fluorescente reporter.

O ensaio pode ser realizado utilizando um sistema de deteção de sequências ABI Prism 7900HT com alta capacidade de processamento e baixos custos operacionais. O sistema ABI Prism 7900HT pode distinguir e quantificar as duas cores (FAM ou VIC), e genótipos podem ser gerados para muitas amostras em poucos minutos.

Vantagens da Genotipagem de SNP TaqMan

• Simples e direto: A genotipagem SNP TaqMan envolve a simples mistura de amostras e componentes da reação num sistema fechado, não requerendo procedimentos complexos e sendo fácil de implementar.
• Deteção em tempo real: Ao detetar alterações na fluorescência durante a reação de PCR, a genotipagem TaqMan SNP permite o monitoramento em tempo real dos genótipos SNP, fornecendo resultados rápidos.
• Evitar o manuseamento pós-PCR: Sem necessidade de procedimentos pós-PCR, elimina os custos laborais e o risco de contaminação cruzada associados ao manuseamento pós-PCR, reduzindo erros experimentais.
• Baixa necessidade de amostra: Devido à sensibilidade das reações de PCR, a genotipagem de SNP TaqMan requer quantidades mínimas de amostra, tornando-a adequada para a análise de amostras limitadas.
• Deteção de amostras em alta capacidade: Com o avanço dos instrumentos de PCR quantitativa por fluorescência, grandes lotes de amostras podem ser detetados simultaneamente em uma única placa de reação, melhorando a eficiência e a capacidade de deteção.
• Alta sensibilidade e especificidade: A genotipagem de SNPs TaqMan oferece alta sensibilidade e especificidade, identificando com precisão os SNPs e evitando erros de julgamento e confusão.
• Baixo requisito de entrada de amostra com ~10ng/genótipo
• Razoável para um grande tamanho de amostra
• Design de projeto personalizado
• Cientistas experientes com considerável experiência em PCR

Aplicação da Genotipagem de SNP TaqMan

• Particularmente vantajoso para cenários de análise de SNP com um número relativamente modesto de loci, mas com tamanhos de amostra superiores a 1500 casos, uma vez que tamanhos de amostra maiores implicam custos mais baixos.
• Investigação Genética: A genotipagem de SNP TaqMan é aplicável em várias áreas de estudos genéticos envolvendo a análise de SNP, abrangendo campos como a genética humana e a reprodução genética de flora e fauna.
• Estudos de associação de SNPs em todo o genoma: Particularmente adequados para validar loci positivos iniciais obtidos a partir de estudos abrangentes de associação de SNPs em todo o genoma. Esta abordagem ajuda a identificar SNPs associados a características ou doenças específicas, facilitando assim uma compreensão abrangente das suas bases genéticas.
• Validação de locais de mutação preliminares de sequenciação do genoma completoNo decorrer de estudos de sequenciação de genoma completo, um número substancial de locais de mutação preliminares é tipicamente identificado. A genotipagem de SNP TaqMan serve como uma ferramenta valiosa para a validação adicional desses locais com grandes tamanhos de amostra, elucidando as suas frequências dentro de populações ou espécies específicas e as suas correlações com características fenotípicas.

Fluxo de Trabalho de Genotipagem SNP TaqMan

Os procedimentos experimentais abrangem várias etapas, incluindo extração de ADN, inspeção da qualidade da amostra, conceção e síntese de sondas, experiências preliminares, deteção realizada através de instrumentos de PCR quantitativa por fluorescência e análise de dados subsequente. Central à reação de PCR está o processo de identificação dos genótipos SNP presentes nas amostras, realizado através da deteção de sinais fluorescentes.

Especificações do Serviço

	Requisitos e preparação da amostra DNA genómico sem degradação severa Quantidade de DNA ≥ 1 µg, concentração ≥ 25 ng/µl A pureza deve ter OD260/280 = 1,7~2,0.
	Deteção Sistema de deteção de sequências ABI Prism 7900HT Apropriado para projetos com ~ 1-10 SNPs e 100-1000 amostras.
	Análise de Dados Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Estatísticas de dados brutos Informação de controlo de qualidade Informação sobre genótipo Frequência de SNP Análise de associação … (mais sob pedido)

Pipeline de Análise

Entregáveis

Condições experimentais incluindo informações sobre sequências de primers e sondas, nomes de reagentes, modelos de dispositivos, protocolos, gráficos de clustering e tabelas de genotipagem de cada locus SNP em amostras individuais.

A CD Genomics oferece tecnologia TaqMan altamente confiável e flexível para atender às suas necessidades específicas. Genotipagem de SNPs necessidades.

Referência:

1. Ziller M. J. et al. Sequenciação de bisulfito direcionada do DNA metiloma dinâmico. Epigenética e cromatina, 2016, 9(1): 55.

Resultados da Demonstração

Gráfico de resultados de deteção de genotipagem baseado em sonda TaqMan

Perguntas Frequentes sobre Genotipagem de SNP TaqMan

1. Qual é o princípio de funcionamento da tipagem genética de SNP TaqMan?

Esta tecnologia refere-se a genotipagem de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) abordagem, meticulosamente desenvolvida pela equipa de investigação da ABI. O princípio de funcionamento foi exposto da seguinte forma:

Durante a reação de PCR, é incluído um par de sondas específicas de Minor Groove Binder (MGB), com etiquetas fluorescentes únicas em ambas as extremidades, para discernir diferentes genes alélicos (alelo1 e alelo2). A extremidade 5' possui uma parte fluorescente de reporte, enquanto a extremidade 3' está equipada com uma parte fluorescente de quenching. Ao longo do processo de PCR, ambas as sondas têm a capacidade de se hibridizar e ligar-se seletivamente às sequências complementares localizadas entre os primers direto e inverso.

Quando estas sondas subsistem no seu estado intacto, a transferência de ressonância de energia instiga os grupos fluorescentes a emitir uma fluorescência ténue. Uma vez que a sonda específica se liga exclusivamente ao seu gene alélico correspondente, a DNA polimerase exerce a sua atividade exonuclease de 5' para 3'; clivando o grupo fluorescente reportador e libertando-o do efeito de quenching dos grupos fluorescentes de 3'—isto resulta na emissão de fluorescência.

As duas sondas estão claramente marcadas: a extremidade 5' apresenta fluorescência diversa (seja FAM ou VIC), enquanto a extremidade 3' está ligada a um complexo de grupo de quencher MGB. As variações nas fluorescências detetadas podem, assim, ser utilizadas para inferir o genótipo alélico SNP das respetivas amostras.

2. Quais são as vantagens da genotipagem de SNPs com TaqMan?

A genotipagem SNP TaqMan oferece simplicidade, evitando contaminação cruzada durante o manuseio pós-PCR; deteção em tempo real de loci SNP, proporcionando resultados rápidos; requisito mínimo de amostra, adequado para amostras limitadas; análise simultânea de grandes lotes de amostras, aumentando a eficiência de deteção e o rendimento.

3. Em quais áreas de investigação é aplicável a genotipagem de SNPs TaqMan?

A genotipagem de SNP TaqMan é aplicável a várias áreas de investigação genética envolvendo Genotipagem de SNPs, incluindo genética humana, e reprodução de animais e plantas. É particularmente adequado para estudos de validação adicionais de loci positivos iniciais obtidos a partir de estudos de associação SNP de genoma completo, e um grande número de loci de mutação de triagem preliminar obtidos de sequenciação do genoma completo.

4. O que é que a genotipagem de SNPs TaqMan contribui para o diagnóstico clínico?

As aplicações práticas da genotipagem de SNP TaqMan no âmbito do diagnóstico clínico são significativas. Através da utilização eficaz deste processo, os clínicos são capacitados a descobrir variações genéticas específicas de certas doenças. Subsequentemente, esses conhecimentos são utilizados para elaborar planos de tratamento personalizados às necessidades de cada paciente. Além disso, a genotipagem de SNP TaqMan pode potencialmente permitir a criação de medidas preventivas proativas, abrindo assim portas para a medicina preventiva.

5. Quais são as medidas para prevenir resultados falso-positivos em experimentos de genotipagem de SNP com TaqMan?

A questão das ocorrências de falsos positivos em experimentos de genotipagem SNP TaqMan é de considerável atenção. É crucial impor diversas medidas de controlo para aumentar a precisão e fiabilidade dos resultados obtidos. Exemplos de verificações e controlos implementáveis incluem a inclusão de amostras de controlo negativo e a execução de numerosos experimentos reproduzíveis. Essas estratégias servem para reduzir a incidência de imprecisões nos resultados da pesquisa.

6. Como é que a genotipagem de SNP TaqMan se compara a outros métodos de genotipagem?

Em comparação com alternativas Genotipagem de SNPs As técnicas de genotipagem de SNP TaqMan oferecem uma sensibilidade, especificidade e rapidez elevadas, juntamente com facilidade de implementação. Consequentemente, tem sido amplamente adotada em aplicações práticas.

7. Como devem ser abordadas as falhas em experimentos de genotipagem de SNP TaqMan?

Em casos de falha experimental, uma abordagem sistemática é justificada. Isso inclui uma revisão meticulosa dos procedimentos experimentais para garantir a precisão dos mesmos, avaliação da frescura e qualidade dos reagentes, análise de potenciais contaminações e problemas técnicos, e exploração de ajustes nas condições experimentais com o objetivo de melhorar os resultados.

Estudos de Caso de Genotipagem de SNP TaqMan

Genotipagem de SNP usando a tecnologia TaqMan®: o CYP2D6*17 dilema do ensaio

Revista: Relatórios Científicos

Fator de impacto: 4,746

Publicado: 19 de março de 2015

Fundo

CYP2D6 é uma enzima crítica no metabolismo de fármacos, envolvida no metabolismo de uma parte significativa dos medicamentos utilizados clinicamente. A sua atividade varia amplamente entre populações, influenciando a eficácia dos medicamentos e os eventos adversos. Mais de 100 variantes alélicas foram identificadas, impactando os fenótipos de metabolismo de fármacos. Os ensaios TaqMan são comumente utilizados para CYP2D6 genotipagem, mas os desafios persistem devido à complexidade genética. Descobertas inesperadas em ensaios TaqMan levaram a uma investigação mais aprofundada sobre a precisão das chamadas de genótipo, destacando a necessidade de validação rigorosa dos ensaios e de compreensão das correlações genótipo-fenótipo para a medicina personalizada.

Métodos

Resultados

Os ensaios TaqMan foram utilizados para genotipar casos de CYP2D6 variantes, revelando inconsistências nas chamadas para o SNP 1023C>T. A contaminação e problemas de qualidade do DNA foram descartados. Uma investigação adicional agrupou os sujeitos em portadores de CYP2D6*17 e 4 alelos. Os casos apresentaram chamadas homozigóticas para 1023C>T, posteriormente identificadas como portadoras de uma subvariante CYP2D64 com um trio de SNPs específico. Outros mostraram chamadas consistentes ou duplicações de genes. Estas descobertas destacam a complexidade de CYP2D6 genotipagem e a necessidade de métodos de análise precisos.

Figura 1. Subvariantes CYP2D6*4.

CYP2D6 A genotipagem em três instituições identificou 16 sujeitos de ascendência africana com SNPs chave heterozigóticos, mas homozigóticos para 1023T/T. Foi sugerido que eles apresentassem uma nova. CYP2D6*4 subvariante que apresenta o SNP 1023C>T. No entanto, a análise de RFLP contradisse os resultados do TaqMan, indicando heterozigose para 1023C>T. O re-sequenciamento do gene confirmou as descobertas do RFLP, revelando SNPs comuns em CYP2D6*4 variantes. Isto destaca a complexidade de CYP2D6 genotipagem e a necessidade de métodos de análise abrangentes.

Figura 2. CYP2D6*17 Resultados do Genótipo do Assay TaqMan (1023C>T).

A colaboração com a Thermo Fisher levou à testagem de uma alternativa. CYP2D6*17 design de ensaio. Este novo design corrigiu a má genotipagem observada em ensaios anteriores, identificando heterozigose para CYP2D6*17 SNP em amostras anteriormente homozigóticas. Amostras com CYP2D6*4O genótipo /4 foi chamado com precisão. A análise da estrutura secundária do produto da PCR do ensaio sugeriu diferenças entre CYP2D6*17 e *4 variantes, potencialmente influenciando o desempenho do ensaio.

Figura 3. Comparação de Sequências de CYP2D6 variantes, CYP2D7 e CYP2D8

Figura 4. Amplificação em tempo real para o original e alternativo CYP2D6*17 Ensaios TaqMan.

Conclusão

O mecanismo por trás da perda de alelos permanece elusivo, possivelmente envolvendo as propriedades da polimerase Taq ou estruturas secundárias. Este fenômeno inesperado destaca a necessidade de uma validação rigorosa dos ensaios e vigilância na interpretação dos resultados, particularmente em genes altamente polimórficos como CYP2D6.

Referência:

1. Gaedigk A, Freeman N, Hartshorne T, et al. Genotipagem de SNP utilizando a tecnologia TaqMan®: o CYP2D6* 17 enigma do ensaio. Relatórios científicos, 2015, 5(1): 9257.