Sequenciação CRISPR

A CD Genomics oferece validação de knockout CRISPR-Cas9 e deteção potencial de off-target de forma de alto rendimento e custo-efetivo, aproveitando tecnologias avançadas. sequenciação de próxima geração (NGS)Os membros da nossa equipa têm experiência tanto em edição de genoma como em NGS, permitindo um apoio extensivo à sua investigação.

O que é CRISPR?

CRISPR, abreviação de Repetições Palindrómicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaciadas, é uma tecnologia revolucionária de edição genética que tem origem nos sistemas imunitários naturais de bactérias e arqueias. Este sistema é um componente crucial da defesa imunitária procariótica, permitindo que estes organismos capturem fragmentos de ADN viral e os utilizem para detectar e destruir sequências virais semelhantes durante infecções subsequentes. Em essência, o CRISPR permite que os vírus integrem o seu material genético nas bactérias, aproveitando a maquinaria celular bacteriana para replicar os seus próprios genes, um processo que chamamos de edição genética.

Os componentes principais do sistema CRISPR incluem:

• Loci CRISPREsses loci consistem em sequências genéticas repetitivas intercaladas com "espaçadores", que são fragmentos de DNA viral capturados de infecções anteriores.
• Proteínas Cas (proteínas associadas ao CRISPR)A Cas9, por exemplo, é uma enzima que pode cortar o DNA em locais específicos, guiada por sequências de RNA.
• RNA guia (gRNA)Esta é uma curta sequência de RNA complementar à sequência de DNA alvo, direcionando a enzima Cas9 para o local preciso no genoma onde a edição é desejada.

O que é o sistema CRISPR-Cas9?

O sistema de direcionamento genético CRISPR-Cas9, que requer dois componentes: um RNA guia personalizado (sgRNA, consistindo de uma sequência crRNA específica para o alvo e tracrRNA) e uma endonuclease associada ao CRISPR não específica (Cas9), é uma nova ferramenta de engenharia genómica que permite aos investigadores editar partes do genoma, removendo, adicionando ou alterando uma seção da sequência de DNA em organismos. Atualmente, é o método de manipulação genética mais simples, versátil, preciso e eficaz, com muitas aplicações potenciais, incluindo medicina e melhoria de sementes de culturas. O CRISPR-Cas9 também foi adaptado para permitir edição genómica em alta capacidade e revolucionou a geração de mutações direcionadas.

Introdução ao Sequenciamento CRISPR

O sequenciamento CRISPR é uma metodologia avançada que integra a tecnologia de edição genética CRISPR com sequenciação de alto rendimento, destinada a manipular precisamente o genoma e a analisar os efeitos resultantes. CRISPR, um acrónimo para Repetições Palindrómicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaciadas, deriva de um mecanismo imunológico bacteriano e utiliza proteínas Cas (associadas ao CRISPR) guiadas por moléculas de RNA específicas para direcionar e editar sequências de DNA. Esta técnica não só permite modificações genómicas direcionadas, mas também possibilita uma análise abrangente a montante, oferecendo um potencial significativo tanto na investigação básica como na biotecnologia aplicada.

Em experimentos de CRISPR, a validação de edições genéticas é fundamental. O NGS oferece uma abordagem simples e de alto rendimento para a análise de mutações desejadas, dado o potencial de ocorrência de modificações fora do alvo em vez das edições genéticas pretendidas. O sequenciamento de amplicons de CRISPR tornou-se a técnica de validação padronizada em domínios académicos, clínicos e industriais. A triagem de CRISPR de alto rendimento aproveita os princípios do sequenciamento de amplicons direcionados ao empregar primers que flanqueiam as regiões-alvo para amplificação por PCR. O sequenciamento de amplicons direcionados é o método mais sensível para a deteção de mutações, capaz de identificar mutações com frequências tão baixas quanto 0,01%.

Para responder às necessidades emergentes das comunidades de investigação, a CD Genomics desenvolveu uma estratégia acessível, fiável e de alto rendimento para rastrear e validar mutações baseadas em CRISPR-Cas9, aproveitando a sequenciação de próxima geração baseada em amplicões. O nosso serviço de sequenciação de próxima geração CRISPR pode fornecer informações diretas e detalhadas sobre a natureza e diversidade das mutações, incluindo a confirmação de alelos knockout/knockin, avaliação da eficiência de corte dos sgRNAs, identificação de homozigotos e heterozigotos, e cálculo das frequências de mutação. et al..

Vantagens do Nosso Serviço de Sequenciação CRISPR

• A alta precisão do sistema CRISPR/Cas9 permite a seleção e edição precisas de loci genómicos específicos.
• Esta versatilidade facilita uma variedade de modificações genómicas, incluindo knockout de genes, knock-ins, mutações pontuais e regulação genética.
• Flexibilidade de multiplexação extensiva e sequenciação de alto rendimento, até 10.⁴ amostras por corrida
• Sequenciação ultra-profunda de amplicões ou regiões capturadas, com mais de 1000X de cobertura.
• Deteção económica e altamente sensível sem viés.
• Não há necessidade de etapas de clonagem laboriosas e que consomem tempo.
• Apoio dedicado de cientistas especializados com doutoramento.

Aplicações da Sequenciação CRISPR

• Genómica Funcional: Este campo investiga a função dos genes e os papéis que os genes desempenham nos processos biológicos, proporcionando uma compreensão abrangente das contribuições genómicas para várias atividades celulares.
• Terapia Génica: Focando na correção de mutações patogénicas responsáveis por doenças hereditárias, a terapia génica visa restaurar a função normal dos genes e aliviar os sintomas da doença.
• Biotecnologia Agrícola: Esta disciplina envolve o aprimoramento das características das culturas, como a resistência a doenças e o rendimento, através de modificações genéticas, contribuindo assim para a produtividade e sustentabilidade agrícola.
• Investigação do Cancro: Dedicada a elucidar os papéis dos genes relacionados com tumores, a investigação do cancro explora os mecanismos da oncogénese e da progressão do cancro, abrindo caminho para novas estratégias terapêuticas.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação CRISPR

A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade seguindo cada procedimento para garantir resultados abrangentes e precisos. O nosso fluxo de trabalho de sequenciação de mutações CRISPR está descrito abaixo, incluindo isolamento de DNA, experiências de PCR, sequenciação profunda e análise de dados. A nossa sequenciação de mutações CRISPR permite que os investigadores validem a biblioteca de guias, validem os alvos CRISPR/Cas9 e a eficiência de mutação, bem como descubram os locais-alvo mais promissores.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Tipos de amostras: amostras de células ou DNA após manipulação de edição genética CRISPR-Cas. Amostra de ADN: ~1 μg (concentração ≥ 30 ng/μl; OD260/280=1.8~2.0) Amostra celular: 1×106 células ou 10 cm2 cultura celular Os procedimentos de preparação de amostras abrangem a isolação, purificação, quantificação e controlo de qualidade do DNA. etc.. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Plataformas Illumina HiSeq, paired-end de 150 bp ou 300 bp; plataforma SMRT da PacBio. Profundidade de sequenciação: ≥ 1000x Análise de métricas de qualidade de sequenciação
	Análise Bioinformática Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: QC de dados brutos Alinhamento de referência Validação de bibliotecas CRISPR Análise de locos-alvo Análise dos loci fora do alvo previstos Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação CRISPR para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece serviços abrangentes para detectar potenciais efeitos fora do alvo através de enriquecimento direcionado e sequenciação profunda, tudo a preços competitivos. As nossas capacidades avançadas permitem sequenciar centenas de amostras simultaneamente, garantindo um processamento eficiente e alta capacidade de produção. Os padrões de distribuição de inserções e deleções (InDels) serão analisados meticulosamente, e as mutações serão verificadas utilizando a robusta ferramenta CRISPResso. Se tiver mais requisitos ou perguntas, não hesite em entrar em contacto connosco.

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Perguntas Frequentes sobre CRISPR Seq

1. É o CRISPR-Cas9 sequenciação de próxima geração?

Sequenciação de próxima geração (NGS) desempenha um papel integral em várias etapas dos fluxos de trabalho de edição genómica CRISPR-Cas9. As suas aplicações variam desde o sequenciamento genómico abrangente para analisar potenciais efeitos fora do alvo do CRISPR, até ao sequenciamento direcionado com o objetivo de confirmar knockouts específicos de genes e outras edições. Ao empregar NGS, os investigadores podem alcançar uma validação detalhada e precisa das modificações induzidas pelo CRISPR, garantindo a precisão e fiabilidade das suas alterações genéticas.

2. Quais são as considerações éticas do sequenciamento CRISPR?

A sequenciação CRISPR levanta preocupações éticas, particularmente em relação ao potencial de mutações fora do alvo e às implicações da edição da linha germinativa. As diretrizes éticas enfatizam a necessidade de avaliações rigorosas de segurança, consentimento informado e transparência na investigação envolvendo tecnologias de edição genética.

3. Como é que os investigadores garantem a especificidade dos resultados de sequenciação CRISPR?

Os investigadores utilizam ferramentas de bioinformática para analisar dados de sequenciação e distinguir mutações induzidas por CRISPR genuínas de ruído de fundo ou erros de sequenciação. Além disso, técnicas de validação como Sequenciação de Sanger ou a PCR digital em gota (ddPCR) pode confirmar a presença de mutações em locais genómicos específicos.

4. Como é que o sequenciamento CRISPR é utilizado na investigação clínica e na terapia?

No domínio da investigação clínica, o sequenciamento CRISPR desempenha um papel integral na promoção de perspetivas terapêuticas para distúrbios genéticos. Esta tecnologia facilita a validação precisa de modificações genómicas em células derivadas de pacientes, permitindo assim que os investigadores analisem minuciosamente a eficácia e os perfis de segurança das terapias genéticas antes dos ensaios clínicos. Além disso, o sequenciamento CRISPR é fundamental na elucidação dos mecanismos da doença e na identificação de potenciais alvos terapêuticos, promovendo uma compreensão mais profunda que pode impulsionar o desenvolvimento de estratégias de tratamento inovadoras.

Estudos de Caso de Sequenciamento CRISPR

Análises de off-target em todo o genoma da engenharia do receptor de células T mediada por CRISPR/Cas9 em células T humanas primárias

Revista: Imunologia Clínica e Translacional

Fator de impacto: 5,8

Publicado: 23 de janeiro de 2022

Fundo

A utilização de células T para a defesa contra o câncer é uma abordagem proeminente nas estratégias imunoterapêuticas contemporâneas. A engenharia genética de Receptores de células T (TCRs) permite a redireção da especificidade das células T, a eliminação da alorreatividade e o avanço da terapia de transferência de células T adotivas (ACT). A introdução de quebras de dupla hélice de DNA através da tecnologia CRISPR/Cas9 facilita manipulações de knockout ou knock-in de genes. Um método eficaz para determinar a segurança das células T engenheiradas envolve a deteção de genes fora do alvo em todo o genoma. Aproveitando as técnicas CRISPR/Cas9, os autores utilizaram a entrega de ribonucleoproteínas para eliminar o TCR, permitindo-lhes avaliar a segurança das células T geneticamente engenheiradas. Sequenciação do genoma completo foi posteriormente contratado para investigar se quebras de dupla hélice mediadas por CRISPR/Cas9 em locais de TCR estão associadas a efeitos fora do alvo em células T primárias.

Materiais e Métodos

Resultados

Fig 1. Análise do genoma completo dos efeitos fora do alvo induzidos pelo Cas9 dependente de gRNA.

Fig. 2. Sequenciação profunda direcionada de eventos fora do alvo previamente identificados por WGS.

A segurança das células T foi avaliada através da análise de incidentes fora do alvo induzidos por nucleases não específicas. Utilizando o Cas-OFFinder, os autores pesquisaram locais correspondentes com uma discrepância de ≤ 4 entre o RNA guia (gRNA) e o DNA não alvo, considerando-os como possíveis locais fora do alvo. Subsequentemente, foi realizada sequenciação do genoma completo em amostras não tratadas e amostras MOCK. Os resultados revelaram que a eletroporação sozinha não produziu variações genómicas significativas.

Os autores realizaram então sequenciação do genoma completo em amostras sujeitas a edições TRAC e TRBC, excluindo os InDels encontrados em amostras não tratadas e MOCK. Utilizando um alinhamento de sequência homóloga de genoma completo baseado no RNA guia único (sgRNA), identificaram 316 InDels distintos nas amostras editadas TRAC e 272 InDels distintos nas amostras editadas TRBC. Estes potenciais locais fora do alvo foram posteriormente compilados pelos autores.

Conclusão

Em resumo, este estudo investiga a segurança da engenharia genética mediada por CRISPR/Cas9 em recetores de células T (TCR), com o objetivo de avaliar efeitos fora do alvo. Utilizando uma abordagem combinada de previsão de alvo enviesada, sequenciação do genoma completo não enviesada e sequenciação profunda direcionada, o estudo confirmou uma alta eficiência na eliminação de TCR sem detectar quaisquer mutações InDel fora do alvo induzidas por CRISPR/Cas9. No entanto, são necessárias mais investigações in vivo para avaliar completamente a segurança clínica dos produtos de células T geneticamente modificados.

Referência

1. Kaeuferle T, Stief T A, Canzar S, et al. Análises de off-target em todo o genoma da engenharia do receptor T de células T mediada por CRISPR/Cas9 em células T humanas primárias. Clínico & Imunologia Translacional, 2022, 11(1): e1372.