Sequenciação CRISPR

A CD Genomics oferece validação de knockout CRISPR-Cas9 e deteção potencial de off-target de forma eficiente em termos de custo e em alta capacidade, aproveitando tecnologias avançadas. sequenciação de próxima geração (NGS)Os membros da nossa equipa têm experiência tanto em edição de genoma como em NGS, permitindo um suporte extensivo à sua investigação.

O que é o CRISPR?

CRISPR, abreviação de Repetições Palindrómicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaced, é uma tecnologia revolucionária de edição de genes que tem origem nos sistemas imunitários naturais de bactérias e arqueias. Este sistema é um componente crucial da defesa imunitária procariótica, permitindo que estes organismos capturem fragmentos de ADN viral e os utilizem para detetar e destruir sequências virais semelhantes durante infecções subsequentes. Em essência, o CRISPR permite que os vírus integrem o seu material genético nas bactérias, aproveitando a maquinaria celular bacteriana para replicar os seus próprios genes, um processo que chamamos de edição genética.

Os componentes principais do sistema CRISPR incluem:

• Loci CRISPREstes loci consistem em sequências genéticas repetitivas intercaladas com "spacers," que são fragmentos de DNA viral capturados de infeções anteriores.
• Proteínas Cas (proteínas associadas ao CRISPR)A Cas9, por exemplo, é uma enzima que pode cortar o DNA em locais específicos, guiada por sequências de RNA.
• RNA guia (gRNA)Esta é uma curta sequência de RNA complementar à sequência de DNA alvo, direcionando a enzima Cas9 para o local preciso no genoma onde a edição é desejada.

O que é o sistema CRISPR-Cas9?

O sistema de direcionamento genético CRISPR-Cas9, que requer dois componentes: um RNA guia personalizado (sgRNA, composto por uma sequência crRNA específica para o alvo e tracrRNA) e uma endonuclease associada ao CRISPR não específica (Cas9), é uma nova ferramenta de engenharia genómica que permite aos investigadores editar partes do genoma, removendo, adicionando ou alterando uma secção da sequência de DNA em organismos. Atualmente, é o método mais simples, versátil, preciso e eficaz de manipulação genética, com muitas aplicações potenciais, incluindo medicina e melhoria de sementes de culturas. O CRISPR-Cas9 também foi adaptado para permitir edição genómica em alta capacidade e revolucionou a geração de mutações direcionadas.

Introdução ao Sequenciamento CRISPR

A sequenciação CRISPR é uma metodologia avançada que integra a tecnologia de edição de genes CRISPR com sequenciação de alto rendimento, destinada a manipular precisamente o genoma e analisar os efeitos resultantes. CRISPR, um acrónimo para Repetições Palindrómicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespalhadas, deriva de um mecanismo imunológico bacteriano e utiliza proteínas Cas (associadas ao CRISPR) guiadas por moléculas de RNA específicas para direcionar e editar sequências de DNA. Esta técnica não só permite modificações genómicas direcionadas, mas também possibilita uma análise abrangente a montante, oferecendo um potencial significativo tanto na investigação básica como na biotecnologia aplicada.

Em experiências de CRISPR, a validação de edições genéticas é primordial. O NGS oferece uma abordagem simples e de alto rendimento para a análise de mutações desejadas, dado o potencial de ocorrência de modificações fora do alvo em vez das edições genéticas pretendidas. O sequenciamento de amplicons de CRISPR tornou-se a técnica de validação padronizada em domínios académicos, clínicos e industriais. A triagem de CRISPR de alto rendimento aproveita os princípios do sequenciamento de amplicons direcionados, utilizando primers que flanqueiam as regiões-alvo para a amplificação por PCR. O sequenciamento de amplicons direcionados é o método mais sensível para a deteção de mutações, capaz de identificar mutações com frequências tão baixas quanto 0,01%.

Para atender às necessidades emergentes das comunidades de pesquisa, a CD Genomics desenvolveu uma estratégia acessível, fiável e de alto rendimento para rastrear e validar mutações baseadas em CRISPR-Cas9, aproveitando a sequenciação de próxima geração baseada em amplicões. O nosso serviço de sequenciação de próxima geração CRISPR pode fornecer informações diretas e detalhadas sobre a natureza e diversidade das mutações, incluindo a confirmação de alelos knockout/knockin, avaliação da eficiência de corte dos sgRNAs, identificação de homozigotos e heterozigotos, e cálculo das frequências de mutação. et al..

Vantagens do Nosso Serviço de Sequenciação CRISPR

• A alta precisão do sistema CRISPR/Cas9 permite a localização e edição precisas de loci genómicos específicos.
• Esta versatilidade facilita uma variedade de modificações genómicas, incluindo knockout de genes, knock-ins, mutações pontuais e regulação genética.
• Flexibilidade de multiplexação extensiva e sequenciação de alto rendimento, até 10⁴ amostras por corrida
• Sequenciação ultra-profunda de amplicões ou regiões capturadas, com mais de 1000X de cobertura.
• Deteção económica e altamente sensível sem viés.
• Não há necessidade de passos de clonagem laboriosos e que consomem tempo.
• Apoio dedicado de cientistas especializados com doutoramento.

Aplicações da Sequenciação CRISPR

• Genómica Funcional: Este campo investiga a função dos genes e os papéis que os genes desempenham nos processos biológicos, proporcionando uma compreensão abrangente das contribuições genómicas para várias atividades celulares.
• Terapia Génica: Focando na correção de mutações patogénicas responsáveis por doenças hereditárias, a terapia génica visa restaurar a função normal dos genes e aliviar os sintomas da doença.
• Biotecnologia Agrícola: Esta disciplina envolve a melhoria das características das culturas, como resistência a doenças e rendimento, através de modificações genéticas, contribuindo assim para a produtividade e sustentabilidade agrícola.
• Investigação do Cancro: Dedicada a elucidar os papéis dos genes relacionados com tumores, a investigação do cancro explora os mecanismos da oncogénese e da progressão do cancro, abrindo caminho para novas estratégias terapêuticas.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação CRISPR

A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade seguindo todos os procedimentos para garantir resultados abrangentes e precisos. O nosso fluxo de trabalho de sequenciação de mutações CRISPR está descrito abaixo, incluindo isolamento de DNA, experiências de PCR, sequenciação profunda e análise de dados. A nossa sequenciação de mutações CRISPR permite que os investigadores validem a biblioteca de guias, validem os alvos CRISPR/Cas9 e a eficiência das mutações, bem como descubram os locais-alvo mais promissores.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Tipos de amostras: amostras de células ou DNA após manipulação de edição genética CRISPR-Cas. Amostra de DNA: ~1 μg (concentração ≥ 30 ng/μl; OD260/280=1.8~2.0) Amostra celular: 1×106 células ou 10 cm2 cultura celular Os procedimentos de preparação de amostras abrangem a isolação, purificação, quantificação e controlo de qualidade do DNA. etc.. Nota: Os montantes de amostra são listados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Plataformas Illumina HiSeq, paired-end de 150 bp ou 300 bp; plataforma SMRT da PacBio. Profundidade de sequenciação: ≥ 1000x Análise de métricas de qualidade de sequenciação
	Análise Bioinformática Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: QC de dados brutos Alinhamento de referência Validação de bibliotecas CRISPR Análise de loci-alvo Análise de loci fora do alvo previstos Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação CRISPR para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece serviços abrangentes para detectar potenciais efeitos fora do alvo através de enriquecimento direcionado e sequenciação profunda, tudo a preços competitivos. As nossas capacidades avançadas permitem sequenciar centenas de amostras simultaneamente, garantindo um processamento eficiente e uma elevada capacidade de produção. Os padrões de distribuição de inserções e deleções (InDels) serão analisados meticulosamente, e as mutações serão verificadas utilizando a robusta ferramenta CRISPResso. Se tiver mais requisitos ou perguntas, não hesite em entrar em contacto connosco.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

1. É o CRISPR-Cas9 sequenciação de próxima geração?

Sequenciação de próxima geração (NGS) desempenha um papel integral em várias etapas dos fluxos de trabalho de edição do genoma CRISPR-Cas9. As suas aplicações vão desde o sequenciamento genómico abrangente para analisar potenciais efeitos fora do alvo do CRISPR, até ao sequenciamento direcionado com o objetivo de confirmar knockouts específicos de genes e outras edições. Ao empregar NGS, os investigadores podem alcançar uma validação detalhada e precisa das modificações induzidas pelo CRISPR, garantindo a precisão e fiabilidade das suas alterações genéticas.

2. Quais são as considerações éticas do sequenciamento CRISPR?

A sequenciação CRISPR levanta preocupações éticas, particularmente em relação ao potencial de mutações fora do alvo e às implicações da edição da linha germinativa. As diretrizes éticas enfatizam a necessidade de avaliações rigorosas de segurança, consentimento informado e transparência na investigação envolvendo tecnologias de edição genética.

3. Como é que os investigadores garantem a especificidade dos resultados da sequenciação CRISPR?

Os investigadores utilizam ferramentas de bioinformática para analisar dados de sequenciação e distinguir mutações induzidas por CRISPR genuínas de ruído de fundo ou erros de sequenciação. Além disso, técnicas de validação como Sequenciação de Sanger ou a PCR digital em gota (ddPCR) pode confirmar a presença de mutações em locais genómicos específicos.

4. Como é que o Sequenciamento CRISPR é utilizado na investigação clínica e na terapia?

No domínio da investigação clínica, a sequenciação CRISPR desempenha um papel integral na promoção de perspetivas terapêuticas para distúrbios genéticos. Esta tecnologia facilita a validação precisa de modificações genómicas em células derivadas de pacientes, permitindo assim que os investigadores analisem minuciosamente a eficácia e os perfis de segurança das terapias genéticas antes dos ensaios clínicos. Além disso, a sequenciação CRISPR é fundamental na elucidação dos mecanismos da doença e na identificação de potenciais alvos terapêuticos, promovendo uma compreensão mais profunda que pode impulsionar o desenvolvimento de estratégias de tratamento inovadoras.

Análises de off-target em todo o genoma da engenharia do receptor de células T mediada por CRISPR/Cas9 em células T humanas primárias

Jornal: Imunologia Clínica e Translacional

Fator de impacto: 5,8

Publicado: 23 de janeiro de 2022

Fundo

A utilização de células T para a defesa contra o câncer é uma abordagem proeminente nas estratégias imunoterapêuticas contemporâneas. A engenharia genética de Receptores de células T (TCRs) permite a redireção da especificidade das células T, a eliminação da aloreatividade e o avanço da terapia de transferência de células T adotivas (ACT). A introdução de quebras de dupla hélice de DNA através da tecnologia CRISPR/Cas9 facilita manipulações de knockout ou knock-in de genes. Um método eficaz para determinar a segurança das células T engenheiradas envolve a deteção de genes fora do alvo em todo o genoma. Aproveitando as técnicas CRISPR/Cas9, os autores utilizaram a entrega de ribonucleoproteínas para eliminar o TCR, permitindo-lhes avaliar a segurança das células T geneticamente engenheiradas. Sequenciação do genoma completo foi posteriormente contratado para investigar se quebras de dupla cadeia mediadas por CRISPR/Cas9 em locais de TCR estão associadas a efeitos fora do alvo em células T primárias.

Materiais e Métodos

Resultados

Fig 1. Análise do genoma completo dos efeitos off-target induzidos pelo Cas9 dependentes de gRNA.

Fig 2. Sequenciação profunda direcionada de eventos fora do alvo previamente identificados por WGS.

A segurança das células T foi avaliada através da análise de incidentes fora do alvo induzidos por nucleases não específicas. Utilizando o Cas-OFFinder, os autores pesquisaram locais correspondentes com uma discrepância de ≤ 4 entre o RNA guia (gRNA) e o DNA não alvo, considerando-os como possíveis locais fora do alvo. Subsequentemente, foi realizado o sequenciamento do genoma completo em amostras não tratadas e amostras MOCK. Os resultados revelaram que a eletroporação, por si só, não produziu variações genómicas significativas.

Os autores realizaram então sequenciação do genoma completo em amostras sujeitas a edições de TRAC e TRBC, excluindo os InDels encontrados em amostras não tratadas e MOCK. Utilizando um alinhamento de sequência homóloga do genoma completo baseado no RNA guia único (sgRNA), identificaram 316 InDels distintos nas amostras editadas de TRAC e 272 InDels distintos nas amostras editadas de TRBC. Estes potenciais locais fora do alvo foram posteriormente compilados pelos autores.

Conclusão

Em resumo, este estudo investiga a segurança da engenharia genética mediada por CRISPR/Cas9 nos recetores de células T (TCR), com o objetivo de avaliar os efeitos fora do alvo. Usando uma abordagem combinada de previsão de alvo enviesada, sequenciação do genoma completo não enviesada e sequenciação profunda direcionada, o estudo confirmou uma alta eficiência na eliminação de TCR sem detectar quaisquer mutações InDel fora do alvo induzidas por CRISPR/Cas9. No entanto, são necessárias mais investigações in vivo para avaliar completamente a segurança clínica dos produtos de células T geneticamente modificadas.

Referência

1. Kaeuferle T, Stief T A, Canzar S, et al. Análises de off-target em todo o genoma da engenharia do receptor de células T mediada por CRISPR/Cas9 em células T humanas primárias. Clínico & Imunologia Translacional, 2022, 11(1): e1372.