Sequenciação do Genoma de AAV

Qual é o genoma do AAV?

O genoma do AAV (Vírus Adeno-Associado) é uma molécula de DNA de cadeia simples (ssDNA) pequena, mas altamente funcional, com cerca de 4,7 quilobases (kb). Este pacote genético compacto é engenhosamente projetado com várias características-chave:

• Repetições Terminais Invertidas (ITRs)Localizadas em ambas as extremidades do genoma, estas sequências repetitivas são cruciais para o ciclo de vida do vírus. Elas formam estruturas em forma de alça que são vitais para o processo de replicação e para o empacotamento do genoma viral. Estes ITRs também desempenham um papel fundamental na integração do DNA viral no genoma da célula hospedeira.
• Genes RepetidosOs genes Rep (Replicação) codificam proteínas que são essenciais para replicar o genoma do AAV e regular o seu ciclo de vida. Estas proteínas estão envolvidas na produção de cópias do DNA viral e também podem ajudar na integração do material genético do vírus no genoma do hospedeiro, garantindo que o vírus possa persistir e espalhar-se de forma eficaz.
• Cap GenesOs genes Cap produzem as proteínas que constituem a camada protetora externa do vírus, ou capsídeo. Estas proteínas do capsídeo não são apenas componentes estruturais; elas determinam a capacidade do vírus de infectar tipos específicos de células. Elas também contribuem para a estabilidade do vírus e a sua eficiência em entregar a carga genética.
• Regiões RegulatóriasEstas regiões gerem a expressão dos genes Rep e Cap. Elas atuam como controladores de tráfego, garantindo que a produção de proteínas virais ocorra no momento certo e nas quantidades adequadas ao longo do ciclo de vida do vírus.

O que é o sequenciamento NGS de AAV?

NGS (Sequenciamento de Nova Geração)Sequenciação de Nova Geração) da AAV oferece uma análise aprofundada do genoma viral, revelando uma riqueza de informações sobre a sua estrutura e potenciais problemas. Esta tecnologia de ponta mapeia meticulosamente todo o genoma da AAV, identificando variantes genéticas, mutações e possíveis contaminantes. Tais insights detalhados são cruciais para o ajuste fino dos vetores de AAV utilizados na terapia génica, garantindo que sejam seguros e eficazes. Além disso, o NGS ajuda a determinar a concentração exata de AAV em amostras e confirma a pureza das preparações de vetores, assegurando que estejam livres de elementos virais ou bacterianos indesejados. Em essência, o NGS é uma ferramenta vital que apoia o desenvolvimento preciso, o rigoroso controlo de qualidade e a aplicação bem-sucedida de terapias génicas baseadas em AAV.

Introdução ao Sequenciamento do Genoma de AAV

Os AAVs são atualmente um dos vetores mais amplamente utilizados e significativos para a entrega de terapia genética in vivo. Estes vetores podem entregar cargas genéticas de até 4,7 kb e podem infetar uma variedade diversificada de tipos celulares com patogenicidade mínima. A produção de AAVs começa com a construção de plasmídeos e termina com o empacotamento em partículas virais. Devido às características estruturais do genoma do AAV, produzir vírus AAV com DNA de alta fidelidade é inerentemente desafiador. Para abordar essas complexidades, a CD Genomics oferece soluções abrangentes de sequenciamento do genoma do AAV e controle de qualidade projetadas para otimizar a qualidade dos vetores AAV.

A eletroforese em gel de agarose, PCR/ddPCR e blotting de Southern têm sido amplamente utilizadas para a avaliação do tamanho do genoma do AAV e a identificação de regiões específicas. No entanto, esses métodos são limitados na sua capacidade de fornecer informações sequenciais abrangentes e insights sobre a integridade genómica. Técnicas de sequenciação de terceira geração, notáveis pelas suas capacidades de leitura longa, foram desenvolvidas como soluções potenciais para a análise da integridade do genoma do AAV. No entanto, a natureza intrínseca do genoma do AAV como DNA de cadeia simples (ssDNA) exige a sua conversão em DNA de cadeia dupla antes da preparação da biblioteca para a sequenciação de terceira geração.

Este processo de conversão, juntamente com os terminais modificados presentes nos genomas de AAV, dificulta a análise precisa das sequências terminais. Além disso, os genomas fragmentados de AAV, sendo mais curtos do que os seus homólogos intactos, exibem um viés significativo durante a preparação da biblioteca e o sequenciamento, resultando numa representação desproporcional nos conjuntos de dados de sequenciamento. Consequentemente, a análise da integridade do genoma de AAV utilizando sequenciamento de terceira geração frequentemente produz resultados que subestimam a integridade real, levando a distorções nos dados. Esta distorção tem implicações severas para as revisões de conformidade subsequentes e para o processo de aprovação de medicamentos. Portanto, embora o sequenciamento de terceira geração seja adequado para uma análise precisa das sequências dos genomas de AAV, é inadequado para a avaliação das sequências terminais e da integridade geral do genoma.

À luz do aumento das exigências regulamentares, protocolos de deteção robustos e métodos analíticos são essenciais para garantir a segurança e a conformidade dos AAVs. A CD Genomics lançou serviços de sequenciação do genoma de AAV e de controlo de qualidade com base em tecnologias de sequenciação de alto rendimento. Ao empregar a segunda geração (NGS) e terceira geração (Sequenciação em Tempo Real de Molécula Única) nas análises de sequenciamento, examinamos a pureza do AAV, a integridade da sequência ITR e a precisão da sequência alvo. Os nossos serviços são adaptados para ajudar os clientes no desenvolvimento de medicamentos de terapia génica a melhorar os seus processos de produção de AAV, salvaguardando assim a segurança dos ensaios clínicos subsequentes.

Vantagens do Nosso Serviço de Sequenciação do Genoma AAV

• Resultados PrecisosAtravés de metodologias de sequenciamento precisas, conseguimos o sequenciamento completo das regiões ITR, identificando de forma eficiente e precisa os locais de mutação dentro dessas sequências.
• Sequenciação RápidaA nossa abordagem garante que o sequenciamento das regiões ITR é realizado de forma rápida, resultando em tempos de resposta acelerados para a entrega dos resultados.
• Serviços de Consultoria AbrangentesA CD Genomics oferece suporte técnico contínuo ao longo do ciclo de vida do projeto, seja durante as fases inicial, intermédia ou final.
• Sequenciação de ITR Orientada pela ConformidadeA CD Genomics opera laboratórios totalmente acreditados, equipados com instrumentos de última geração, aderindo rigorosamente a sistemas de controlo de gestão de qualidade e procedimentos operacionais standardizados (SOPs).

Aplicações do Sequenciamento do Genoma de AAV

Pesquisa em Terapia Génica

• Otimização de Vectores AAV
• Avaliação dos Resultados Terapêuticos

Edição do Genoma

• Análise de Eficiência
• Validação de Especificidade

Desenvolvimento de Vacinas

• Otimização do Sistema de Entrega
• Avaliação da Imunogenicidade

Pesquisa Básica

• Exploração do Mecanismo de Infeção
• Impacto das Variantes Virais

Fluxo de Trabalho de Sequenciação do Genoma AAV

A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade seguindo cada procedimento para garantir resultados abrangentes e precisos. O nosso fluxo de trabalho de sequenciação AAV está delineado abaixo, incluindo preparação de bibliotecas, sequenciação e análise bioinformática.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra amostra de gDNA ≥500ng para sequenciação na plataforma Illumina amostra de gDNA ≥5ug para sequenciação na plataforma PacBio Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Plataforma Illumina PE150, saída de dados de 10Gb Plataforma PacBio, leituras CCS de 7-10K
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade de dados Alinhamento à sequência do plasmídeo e ao genoma de referência do hospedeiro Examinar a integridade do genoma Deteção de heterogeneidade Identificação de contaminantes de DNA Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise exibidos são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação do Genoma AAV para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics utiliza sequenciação de genoma completo de leitura curta para realizar a sequenciação do genoma de AAV, integrando Sequenciação de Sanger e plataformas de alto rendimento para avaliações abrangentes. Esta abordagem permite a análise da integridade do genoma, a deteção de heterogeneidade e a identificação de contaminantes de ADN nas preparações de bibliotecas de AAV. Estamos dedicados a aproveitar a nossa vasta experiência e tecnologia de ponta para fornecer serviços superiores e produtos de alta qualidade adaptados às necessidades específicas dos nossos clientes.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

1. Por que escolher AAV para terapia génica?

AAV destaca-se na terapia génica devido ao seu elevado perfil de segurança, baixa imunogenicidade, estabilidade física, amplo tropismo celular e expressão in vivo prolongada. Estas características fazem do AAV um dos vectores mais utilizados na área. A construção de vectores baseados em AAV é uma pedra angular da tecnologia de terapia génica.

Os investigadores realizaram estudos extensivos para otimizar os vetores AAV. Esses esforços incluem a modificação da estrutura genómica do vetor viral, o aumento da sua capacidade de carga, a melhoria do rendimento viral e a melhoria da eficiência de transdução em vários tipos de tecidos. Tais modificações visam adaptar os vetores AAV para atender às necessidades específicas de diferentes doenças.

2. Por que é que o custo do AAV é tão elevado?

• Requisitos de Pureza para Vetores AAV

Os vetores AAV devem cumprir padrões de pureza rigorosos. Capsídeos virais vazios podem desencadear respostas imunes e competir com vetores totalmente encapsulados pela infecção das células do paciente, necessitando de doses mais elevadas para alcançar a eficácia terapêutica. Esta escalada na dosagem não só aumenta o risco de efeitos secundários de altas doses, mas também eleva a potencial hepatotoxicidade e carcinogenicidade. Consequentemente, a realização de uma validação de pureza minuciosa após a construção do vetor AAV torna-se um passo essencial.

• Altas Taxas de Mutação em Estruturas ITR Específicas

O genoma do AAV é flanqueado em ambas as extremidades por sequências de repetição terminal invertida (ITRs), que são cruciais para o empacotamento e replicação do rAAV. No entanto, as regiões ITR em plasmídeos de AAV são instáveis devido às suas sequências palindrómicas e ao alto conteúdo de GC, tornando-as propensas a mutações ou deleções durante a replicação bacteriana. Mesmo com os protocolos experimentais mais padronizados, os plasmídeos de AAV podem apresentar taxas de mutação que variam de 5% a 15%.

• Desafios na Detecção de ITR

Dada a alta frequência de mutações nos ITR, avaliar a integridade das regiões ITR em plasmídeos antes da embalagem viral é crítico. No entanto, estas regiões estão repletas de sequências palindrómicas capazes de formar estruturas secundárias estáveis. Durante o sequenciamento Sanger, estes laços em forma de cabelo estáveis podem inibir a amplificação por PCR, levando a interrupções no sequenciamento e complicando a validação da sequência. Da mesma forma, o método convencional de enzimas de restrição utilizando SmaI para verificar a integridade do ITR pode ser inadequado, uma vez que pequenas deleções podem escapar à deteção através da eletroforese em gel.

Quais são as vantagens de usar AAV como vetor para terapia génica?

AAV tem várias vantagens, incluindo baixa imunogenicidade, uma ampla gama de hospedeiros, propriedades físico-químicas estáveis e expressão a longo prazo de genes exógenos.

Especificamente, estas vantagens são:

• Alto Perfil de SegurançaAAV é geralmente não patogénico para os humanos ou pode causar apenas sintomas muito leves.
• Integração DirecionadaO AAV pode integrar-se especificamente no local AAVS1 no cromossoma 19 humano, o que reduz o risco de mutagénese de inserção associada à integração aleatória observada com outros vetores virais.
• Expressão Génica SustentadaOs sistemas de transferência de genes mediada por AAV facilitam a expressão persistente e estável dos genes introduzidos, que podem ser regulados por elementos genéticos circundantes.
• Amplitude de Anfitrião AmplaO AAV pode infetar uma ampla variedade de tipos de células, incluindo células em divisão e células não em divisão.
• Estabilidade Térmica e QuímicaO sistema de transferência AAV demonstra uma estabilidade térmica significativa e resistência a condições ácidas e alcalinas, assim como a solventes orgânicos, tornando-o conveniente para armazenamento.

Sequenciação da População do Genoma do Vírus Adeno-Associado Alcança Resolução Completa do Genoma do Vetor e Revela Quimeras Humano-Vetor

Revista: Métodos de Terapia Molecular e Desenvolvimento Clínico

Fator de impacto: 4,771

Publicado: 27 de fevereiro de 2018

Fundo

Vírus adeno-associados recombinantes (rAAVs) requerem um controlo de qualidade preciso para terapia génica. Métodos tradicionais como qPCR e eletroforese em gel não capturam totalmente a fragmentação do genoma ou a contaminação. Sequenciação em tempo real de molécula única (SMRT) fornece uma visão detalhada tanto dos genomas rAAV de comprimento total como dos truncados, revelando erros na embalagem do genoma e contaminação por fragmentos de células hospedeiras ou virais. Esta técnica avançada oferece uma análise abrangente das populações de vetores rAAV.

Materiais e Métodos

Resultados

AAV-GPseq utiliza sequenciação SMRT para analisar genomas scAAV de comprimento completo desde os ITRs 5' até 3'. Revela que os cassetes de shRNA levam a genomas mais truncados e permite uma caracterização detalhada das orientações dos ITRs e das razões entre as fitas positiva e negativa, fornecendo informações sobre o empacotamento e a dinâmica de replicação do vetor AAV.

Figura 1. Perfil de Resolução de Partículas Únicas dos Genomas scAAV por AAV-Gpseq.

AAV-GPseq revela que a maioria das leituras do genoma do vetor são mais curtas do que 500 bp, diferindo da análise em gel. Ao utilizar DNA spike-in para normalização, quantifica com precisão genomas de comprimento total versus truncados. Este método mostra que vetores de comprimento total são menos prevalentes do que os resultados tradicionais em gel sugerem.

Figura 2. Avaliação da Abundância de Populações de Genomas AAV Heterogéneos.

AAV-GPseq deteta sequências de backbone de plasmídeos em genomas de vetores ao revelar leituras que se estendem além das regiões ITR. Este método identifica leituras que se alinham com sequências de backbone de plasmídeos, sugerindo a presença de genomas embalados ao contrário ou de comprimento superior ao unitário. A análise também confirma que muitos genomas curtos, com menos de 500 bp, incluem sequências ITR, mas não estão presentes em níveis detectáveis em amostras de vetores purificadas.

Figura 3. Alinhamentos de Populações de Vetores Heterogéneos ao Referencial pCis-Plasmídeo.

Conclusão

Os métodos tradicionais para avaliar a integridade do vetor rAAV são limitados na caracterização de genomas individuais. O AAV-GPseq avança neste aspecto ao analisar genomas do ITR ao ITR, revelando sequências quiméricas e estruturas de plasmídeos. Apesar das suas vantagens, os desafios incluem a sub-representação de sequências quiméricas mais longas e limitações com AAVs de cadeia simples. No geral, o AAV-GPseq melhora a avaliação da qualidade e segurança dos vetores de terapia génica.

Referência

1. Tai P W L, Xie J, Fong K, et al. A sequenciação da população do genoma do vírus adeno-associado alcança a resolução total do genoma do vetor e revela quimeras humano-vetor. Métodos de Terapia Molecular & Desenvolvimento Clínico, 2018, 9: 130-141.