Sequenciação MeRIP (Análise m6A)

A CD Genomics oferece a análise do transcriptoma em larga escala da localização de m6A em transcritos de mRNA e outros RNAs através da sequenciação por imunoprecipitação de RNA metilado (MeRIP-seq). O MeRIP-seq utiliza um anticorpo que detecta e caracteriza especificamente a N6-metiladenosina (m6A) em RNA. Como a 3'UTR do mRNA desempenha um papel importante na estabilidade, localização e tradução do mRNA, e pode afetar a ligação de proteínas reguladoras de RNA a estas regiões, o enriquecimento de m6A nesta região indica que o m6A pode afetar o metabolismo do RNA e a expressão gênica. A inibição das enzimas envolvidas na metilação do RNA também forneceu pistas sobre os potenciais papéis biológicos desta modificação. Assim, a identificação e caracterização de bases modificadas em RNA pode levar a uma melhor compreensão das vias biológicas.

O que é a sequenciação MeRIP?

N6-metiladenosina (m6A), a forma mais prevalente de modificação por metilação dentro do sequências de mRNA dos eucariotos, tem a capacidade de regular funcionalmente o transcriptoma eucarioto, influenciando assim os processos de splicing de mRNA, exportação nuclear, localização, tradução e estabilidade. A presença de m6A RNA em vários processos vitais da vida celular significa que a metilação de mRNA participa em numerosos processos biológicos, como a diferenciação de células-tronco e o ritmo circadiano, e está implicada na patogénese de diversas doenças, incluindo, mas não se limitando a, carcinogénese, obesidade e infertilidade.

A técnica principal para a investigação do transcriptoma em N6-metiladenosina (m6A) é o MeRIP-seq (sequenciação por imunoprecipitação de RNA metilado). O princípio subjacente a este método reside na utilização de anticorpos específicos para m6A para imunoprecipitar fragmentos de RNA com modificações m6A dentro da célula, seguidos pela sequenciação de alto rendimento destes fragmentos de RNA enriquecidos. Associada à análise bioinformática, uma investigação sistemática e aprofundada das modificações m6A pode ser realizada a nível do transcriptoma.

Vantagens do Nosso Serviço de Sequenciamento MeRIP

• Alta flexibilidade: Capaz de sequenciar diretamente fragmentos altamente metilados do transcriptoma de qualquer espécie sem a necessidade de informações de sequência do genoma conhecidas.
• Alta precisão: Capaz de localizar precisamente dentro de uma faixa de 100-200 nucleótidos em torno do local de ligação real.
• Sinal digital: Permite a análise quantitativa e de sequenciamento diretamente em fragmentos metilados, eliminando problemas de reatividade cruzada e ruído de fundo associados aos sinais analógicos fluorescentes de hibridação em chip tradicionais.
• Plataforma abrangente: Experimento MeRIP—Construção de biblioteca, análise de sequenciamento—Validação de qPCR MeRIP, oferecendo um serviço verdadeiramente completo.
• Seleção flexível: Opções para métodos de construção de bibliotecas e tamanhos de fragmentos.
• Boa reprodutibilidade: A abundante experiência em projetos garante a reprodutibilidade experimental, com análise comparativa realizada entre várias amostras.

Aplicação da Sequenciação MeRIP

• Distribuição da metilação de RNA em organismos eucarióticos;
• Metilação de mRNA em animais e plantas e o seu mecanismo de resposta ao stress ambiental;
• Mecanismos de resistência à degradação do mRNA;
• Mecanismos subjacentes à iniciação e proliferação tumoral;
• Estudos da função biológica de diferentes plantas;
• Iniciação e metastização do câncer; Início e progressão da doença;
• Diferenciação celular, desenvolvimento embrionário e resposta ao stress.

Fluxo de Trabalho de Sequenciamento MeRIP

A CD Genomics realiza a abordagem de mapeamento de m6A utilizando imunoprecipitação com anticorpos específicos para m6A, seguida de NGS (MeRIP-Seq). O RNA selecionado por Poly(A) foi fragmentado em oligonucleotídeos de 100 nucleotídeos de comprimento (input) e imunoprecipitado utilizando um anticorpo purificado por afinidade anti-m6A, sendo posteriormente submetido a sequenciação de próxima geração da Illumina. Como os fragmentos de RNA imunoprecipitados podem conter m6A em qualquer parte do seu comprimento, múltiplos fragmentos diferentes contendo m6A geram leituras sobrepostas. Os locais de m6A foram preditos bioinformaticamente utilizando um algoritmo de detecção de picos e procurando a presença de um subconjunto de motivos DRACH perto do ponto de maior cobertura de leitura.

Fig. 1 Protocolo de sequenciação MeRIP

Especificações do Serviço

	Requisitos de amostra RNA total ≥ 10 μg, Concentração ≥ 1 ng/µL Valor RIN ≥ 7.0 Célula ≥ 1×107 Tecido ≥ 500 mg
	Sequenciação As opções de serviço flexíveis incluem HiSeq X e NextSeq 500.
	Análise Bioinformática Identificação de resíduos de m6A em RNA A distribuição dos picos de m6A ao longo dos transcritos Análise de picos diferenciais

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na sequenciação MeRIP para a sua escrita (personalização)

A conferência de sequenciação MeRIP da CD Genomics foca nas ligações entre a variação celular nos tecidos e a função dos órgãos, além de elucidar as origens das doenças. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Referências:

1. Dominissini D, et al. Topologia dos metilomas de RNA m6A humanos e de rato revelada por m6A-seq. Natureza, 2012 29 de abril; 485(7397):201-6.
2. Jesus D F D, et al. A Metilação m6A do mRNA Regula a Biologia das Células β Humanas em Estados Fisiológicos e na Diabetes Tipo 2. Nature Metabolism2019,1, 765–774.

A Metilação de mRNA m6A Regula a Biologia das Células β Humanas em Estados Fisiológicos e na Diabetes Tipo 2. (Jesus et al., 2019)

1. Poderá o MeRIP-seq estar sujeito a restrições de espécies?

Para espécies com genomas de referência, aqueles montados a nível cromossómico e aqueles com ficheiros de anotação gtf abrangentes, esta metodologia é aplicável. Existem métodos e parâmetros distintos envolvidos no software de deteção de picos para eucariotos, procariotos ou vírus. Portanto, é aconselhável que projetos focados em procariotos ou vírus realizem avaliações preliminares.

2. Por que é necessário medir simultaneamente amostras de Input e IP em experimentos de MeRIP?

O projeto MeRIP é caracterizado por dois componentes: o Input e o IP. No procedimento experimental, a amostra IP utiliza um anticorpo m6A para enriquecer especificamente os fragmentos de RNA metilados. Em contraste, o Input, que consiste apenas em RNA fragmentado, atua como um controlo para mitigar o ruído de fundo. Ambos os componentes IP e Input são processados em paralelo para a construção da biblioteca e sequenciação. Para a análise de deteção de picos, os dados de ambas as amostras devem ser integrados, utilizando os dados do Input para excluir picos correspondentes a níveis de expressão basal elevados ou eventos de ligação não específicos, maximizando assim a precisão na identificação de picos.

3. Quais são as forças e limitações do sequenciamento MeRIP?

A técnica de sequenciação MeRIP oferece várias vantagens:
Alto rendimento: Facilita a análise simultânea de um número substancial de amostras de RNA. Alta sensibilidade: É capaz de detectar modificações m6A com baixa abundância. Resolução espacial: Esta técnica pode determinar com precisão a localização das modificações m6A.

No entanto, a técnica de sequenciação MeRIP também tem limitações:
Dependente de Anticorpos: A seleção e qualidade dos anticorpos podem potencialmente afetar os resultados experimentais.
Precisão: Embora os dados de sequenciação possam fornecer uma localização geral das modificações m6A, não são capazes de identificar a base precisa.
Análise de Dados Complexos: É necessário um elevado grau de habilidades especializadas em análise de dados para interpretar dados de sequenciação e identificar locais de modificação m6A.

4. Qual é o princípio da sequenciação MeRIP?

O princípio da sequenciação Merip baseia-se na tecnologia MeRIP e na sequenciação de RNA de alto rendimento. Inicialmente, as amostras de RNA passam por experiências de MeRIP, onde anticorpos específicos são utilizados para ligar moléculas de RNA modificadas com m6A. Subsequentemente, as moléculas de RNA modificadas com m6A são enriquecidas a partir do RNA total através de imunoprecipitação. Após o enriquecimento, o RNA é submetido a transcrição reversa e preparação de biblioteca para sequenciação de DNA utilizando tecnologia de sequenciação de alto rendimento. Por fim, é realizada a análise dos dados de sequenciação para determinar as posições e abundâncias relativas das modificações m6A.

Os metilomas de RNA revelam a regulação mediada por m6A do gene da desmetilase de DNA SlDML2 na maturação do fruto de tomate.

Revista: Biologia Genómica
Fator de impacto: 14,028
Publicado: 06 de agosto de 2019

Fundos

Está bem estabelecido que as modificações do DNA 5mC e do mRNA m6A desempenham papéis críticos na regulação da expressão génica. A conservação da modificação do DNA 5mC sublinha o seu papel fundamental na modulação de vários processos biológicos. Este estudo destaca a sua conexão com a maturação do fruto. Investigações anteriores mostraram que a mutagénese do gene da desmetilase do DNA SlDML2 em tomates desencadeia hipermetilação em todo o genoma e inibe significativamente a maturação do fruto. No entanto, o papel que o m6A desempenha neste processo, bem como as potenciais interações entre 5mC e m6A, permanecem não categorizadas. Já é conhecido em Arabidopsis que a modificação m6A, mediada pela desmetilase de RNA SlALKBH2, pode regular o gene homólogo da desmetilase do DNA SlDML2.

Métodos

Resultados

A modificação m6A exibe uma mudança dinâmica durante o processo de amadurecimento da fruta, com o nível geral de m6A a diminuir gradualmente à medida que a fruta amadurece, refletindo os padrões de metilação do DNA. Em mutações de defeito de maturação, como a Cnr, juntamente com a hipermetilação do DNA, o nível geral de m6A também é mais elevado.

Figura 1 Dinâmica da metilação do DNA (5mC) e metilação m6A do mRNA na maturação do fruto do tomate.

A modificação de metilação, m6A, está amplamente distribuída no mRNA dos frutos de tomate, exibindo uma relação inversa com os níveis de transcrição gênica.

Os níveis globais de m6A durante a maturação da fruta e no mutante Cnr correspondem à expressão do gene da demetilase m6A SlALKBH2, que está sujeito à regulação por metilação do DNA. SlALKBH2, uma demetilase m6A, tem a capacidade de se ligar ao mRNA do gene da demetilase de DNA, SlDML2, de forma a regular a sua modificação e estabilidade m'6A. Com a mutação do gene SlALKBH2, os níveis aumentados de m6A em SlDML2 coincidem com uma redução do conteúdo de mRNA, impedindo assim a maturação normal da fruta.

Figura 2. SlALKBH2 é necessário para a maturação normal do fruto do tomate.

Conclusão

Este estudo confirma preliminarmente a ligação entre a metilação do DNA e a metilação do RNA, revelando um novo mecanismo de regulação da maturação dos frutos, proporcionando uma nova perspetiva para elucidar a rede de controlo da maturidade dos frutos. Dada a multifuncionalidade da metilação do DNA e da metilação do RNA, o mecanismo de regulação por feedback demonstrado neste estudo também se aplicará a outros processos biológicos.

Referência:

1. Zhou L, Tian S, Qin G. Os metilomas de RNA revelam a regulação mediada por m 6 A do gene da desmetilase de DNA SlDML2 na maturação do fruto de tomate. Biologia do genoma, 2019, 20: 1-23.