Sequenciação de RNA pequeno

Para apoiar o crescente interesse em investigação sobre pequenos RNAs, a CD Genomics está a oferecer um serviço qualificado de sequenciação de pequenos RNAs que abrange a descoberta de novos pequenos RNAs, caracterização de mutações e perfilagem de expressão de pequenos RNAs, aproveitando tecnologias avançadas. tecnologias NGS e pipeline de análise de dados.

A Introdução do Sequenciamento de Pequenos RNAs

As espécies de RNA pequeno geralmente incluem as mais comuns e bem estudadas. microRNA (miRNA)RNA pequeno interferente (siRNA) e RNA interagente com piwi (piRNA), bem como outros tipos de RNA pequeno, como RNA nucleolar pequeno (snoRNA) e RNA nuclear pequeno (snRNA). O RNA pequeno é um tipo de RNA de baixa abundância, curto em comprimento (<200 nt), não codificante de proteínas e que carece de poliadenilação. As populações de RNA pequeno podem variar significativamente entre diferentes tipos de tecidos e espécies. Geralmente, os RNAs pequenos são formados pela fragmentação de sequências de RNA mais longas com a ajuda de conjuntos dedicados de enzimas e outras proteínas.

As RNAs pequenas atuam no silenciamento gênico e na regulação pós-transcricional da expressão gênica. No entanto, a RNA pequena não é suficiente para a indução da interferência de RNA. Geralmente, precisa formar o núcleo do complexo RNA-proteína conhecido como complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Os siRNAs podem clivar o mRNA no meio do duplex mRNA-siRNA, e as metades resultantes do mRNA são degradadas por outras enzimas celulares. Ao contrário da via do siRNA, a degradação mediada por miRNA é iniciada pela remoção enzimática da cauda poliA do mRNA. Os piRNAs são essenciais para o desenvolvimento das células germinativas. As RNAs pequenas demonstraram estar envolvidas em uma série de processos biológicos, incluindo desenvolvimento, proliferação e diferenciação celular, e apoptose.

Ao tirar partido de uma produção tremenda com uma sensibilidade e faixa dinâmica sem precedentes, NGS podem identificar pequenos RNAs expressos de forma fraca, bem como revelar quantitativamente a heterogeneidade em comprimento e sequência. NGS é uma ferramenta poderosa para investigar a função de pequenos RNAs e prever potenciais moléculas-alvo de mRNA sem necessitar de genomas de referência disponíveis. A obtenção de uma biblioteca de sequenciação de pequenos RNAs de alta qualidade começa com a isolação de pequenos RNAs por fracionamento de tamanho utilizando seleção por eletroforese em gel ou colunas de sílica a partir de RNA total. Após a ligação de adaptadores de RNA utilizando um adaptador de DNA adenilado 5' com uma extremidade 3' bloqueada, os pequenos RNAs são transcritos reversamente, amplificados por PCR e sequenciados. Para identificar e anotar miRNAs conhecidos, as leituras de sequenciação podem ser mapeadas para uma base de dados específica da espécie, como mirWalk e miRBase.

Vantagens do Nosso Serviço de Sequenciação de RNA Pequeno

• RNA pequeno e perfilagem de miRNA
• Compreender como a regulação pós-transcricional contribui para o fenótipo.
• Identificação de mais pequenos RNAs não mapeados e isoformas, assim como novos biomarcadores.
• Alta Resolução, Alta Precisão: Detecção de diferenças de nucleotídeos únicos, contando com precisão desde algumas até dezenas de milhares de cópias.
• Alto Rendimento, Alta Qualidade: Obtendo mais de 8 milhões de sequências em uma corrida de sequenciação, curto período experimental, alta eficiência, baixo custo e qualidade fiável.
• Fluxo de Trabalho Analítico Padronizado: Equipas de bioinformática profissionais e serviços de análise para fornecer análises padronizadas, avançadas e personalizadas.
• Experiência extensa em sequenciação e análise de pequenos RNAs: Técnicos de sequenciação profissionais a ajudar no desenho experimental, resolução de problemas e análise de resultados.
• Protocolos de sequenciação de pequenos RNA personalizados: Adaptar planos de sequenciação de pequenos RNA de acordo com necessidades específicas.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Pequenos RNAs

A CD Genomics utiliza as plataformas Illumina HiSeq para sequenciar pequenos RNAs. Temos estratégias flexíveis para a descoberta e perfilagem de miRNA (15-30nt) e/ou pequenos RNAs (30-200nt). A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais. O fluxo de trabalho geral para a sequenciação de pequenos RNAs está delineado abaixo.

Especificação de Serviço

	Requisitos de Amostra RNA total ≥ 1 μg, Quantidade Mínima: 200 ng, Concentração ≥ 20 ng/µl Células ≥ 2×106 Tecido ≥ 500 mg, Quantidade Mínima: 100 mg Relação OD A260/A280 ≥ 1,8, relação A260/230 ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar livres de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciação Bibliotecas de miRNA (15-30nt), RNA pequeno (30-200nt) ou intervalo de tamanho personalizado. Illumina HiSeq SE50 ≥ 10 M leituras Mais de 90% das bases com um escore de qualidade ≥Q30
	Análise de Dados Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade de dados brutos e filtro de comprimento Mapeamento baseado em referência Classificação e quantificação de RNA pequeno Predição e anotação de genes-alvo Predição de pequenos RNAs novos Análise do gene alvo de pequenos RNAs diferencialmente expressos (enriquecimento GO e enriquecimento KEGG) Nota: Os dados recomendados e os conteúdos da análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de RNA Pequeno para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece pacotes completos de serviços de sequenciação de pequenos RNAs, incluindo padronização de amostras, preparação de bibliotecas, sequenciação profunda, controlo de qualidade de dados brutos, montagem do genoma e análise bioinformática personalizada. Podemos adaptar este fluxo de trabalho ao seu interesse de pesquisa. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, sinta-se à vontade para contacte-nos.

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciação

Distribuição A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

Perguntas Frequentes sobre Sequenciação de RNA Pequeno

1. Qual é o fluxo de trabalho para a pré-processamento de dados?

Os primeiros passos são o corte de adaptadores utilizando o FASTX e uma correção opcional de k-mer utilizando o ECHO. Subsequentemente, o perfil de expressão é formado através do mapeamento e anotação do genoma. Se o número de leituras por amostra variar, é aplicada uma normalização para compensar os efeitos de subamostragem.

2. Quantas leituras são necessárias para a sequenciação de pequenos RNAs?

Depende da sua aplicação. Para perfilagem de expressão, uma faixa aceita para leituras mapeadas por amostra é de 100K-2M. Para aplicações de descoberta, devem ser considerados pelo menos 5-10M.

3. Quantas réplicas biológicas preciso para cada condição?

Os replicados biológicos podem aumentar a confiança e reduzir o erro experimental, e recomendamos que submeta pelo menos três replicados por amostra. Note que o número final de replicados é determinado pelas suas condições experimentais finais.

4. Como devo enviar amostras?

Pode enviar com gelo seco ou RNAstable à temperatura ambiente. Empiricamente, o envio de amostras de RNA em RNAstable resulta numa boa qualidade de RNA após a reconstituição.

5. Posso submeter E. coli células ou amostras de tecido?

Sim, além de RNAs, também pode submeter amostras congeladas. E. coli pelotas celulares ou tecidos com gelo seco.

6. É necessária a enriquecimento em poli-A ou a depleção de RNA para a sequenciação de microRNA?

Nenhum enriquecimento é necessário para sequenciação de microRNA porque os adaptadores são ligados seletivamente apenas a pequenos RNAs.

7. Descobri que não conseguia abrir o ficheiro fastq descarregado.

Por favor, certifique-se de que o seu computador tem RAM suficiente para abrir os ficheiros grandes. Pode abri-los com um editor de texto em computadores Windows com RAM suficiente, ou em computadores Linux, que é uma opção preferida. Alternativamente, pode considerar outros leitores específicos para fastq.

Estudos de Caso de Sequenciação de Pequenos RNAs

Descoberta de microRNA inovadores através de sequenciação de RNA pequeno no cérebro humano post-mortem

Revista: BMC Genomics
Fator de impacto: 3,729
Publicado: 4 de Outubro de 2016

Fundo

Os microARNs (miARNs) regulam a expressão génica principalmente através da repressão da tradução de moléculas de mRNA alvo. Mais de 2700 miARNs humanos foram identificados e alguns foram associados a fenótipos de doenças, mostrando padrões de expressão específicos de tecidos. Os autores realizaram estudos de sequenciação de pequenos RNAs em 93 amostras de córtex pré-frontal humano post-mortem de pacientes com doença de Huntington ou doença de Parkinson. E descobriram com sucesso 99 putativos novos miARNs.

Materiais e Métodos

Resultados

Figura 1. Representação em fluxograma do novo pipeline de descoberta de miRNA.

Foram identificados um total de 8891 miARNs.

A análise miRDeep* de dados de sequência de 93 amostras do córtex pré-frontal humano identificou 8891 miRNAs. 3641 miRNAs permaneceram após a filtragem para miRNAs conhecidos da miRBase v20, outros pequenos RNAs e exões. O restante foi filtrado pelo escore miRDeep*. Escores mais altos indicam maior confiança no resultado de um miRNA. No total, 99 miRNAs novos putativos foram finalmente identificados.

Figura 2. miRDeep* miARNs putativos e miARNs do miRBase (A), e localizações genómicas dos miARNs novos putativos (B).

2. Total de 99 miARNs novos putativos

Usando o alinhador SSEARCH, 34 dos 99 putativos novos miRNAs maduros alinharam-se bem a pelo menos um miRNA maduro presente na miRBase v20. A análise de expressão diferencial utilizando modelos lineares ajustados pela idade de morte mostrou que 4 dos 99 miRNAs putativos estão diferencialmente expressos entre amostras de controle e amostras de doença de Huntington, e que 3 estavam diferencialmente expressos entre amostras de controle e amostras de doença de Parkinson (Tabela 2). Os dados detalhados estão apresentados na Tabela 2, gerados pelo LIMMA v. 3.33.7.

Figura 3. MiARNs novos putativos, dados de replicação de miARNs e Londin et al.. miARNs.

Conclusão

Os autores desenvolveram um pipeline utilizando miRDeep*, sequenciação de RNA em pool e filtragem de pontuações para descobrir 99 miRNAs putativos novos a partir de 93 amostras de córtex pré-frontal humano pós-morte. Sete desses miRNAs foram validados experimentalmente, e 19 foram replicados em um conjunto de dados independente. Alguns miRNAs mostraram expressão diferencial entre amostras de HD e controle ou PD e controle, sugerindo papéis potenciais em doenças neurodegenerativas. Estas descobertas sublinham a diversidade dos miRNAs humanos, especialmente em contextos específicos de tecido, e suas potenciais implicações para a compreensão de doenças como HD e PD.

Referência:

1. Wake C, Labadorf A, Dumitriu A, et al.Descoberta de microRNA inovadores utilizando sequenciação de RNA pequeno no cérebro humano pós-morte. BMC Genomics, 2016, 17(1): 776.