Sequenciação de RNA pequeno

Para apoiar o crescente interesse de pesquisa em pequenos RNAs, a CD Genomics está a oferecer um serviço qualificado de sequenciação de pequenos RNAs que abrange a descoberta de novos pequenos RNAs, caracterização de mutações e perfilagem de expressão de pequenos RNAs, aproveitando tecnologia avançada. tecnologias NGS e pipeline de análise de dados.

A Introdução do Sequenciamento de Pequenos RNAs

As espécies de RNA pequeno geralmente incluem as mais comuns e bem estudadas. microRNA (miARN), RNA de interferência pequena (siRNA) e RNA interagente com piwi (piRNA), bem como outros tipos de RNA pequeno, como RNA nucleolar pequeno (snoRNA) e RNA nuclear pequeno (snRNA). O RNA pequeno é um tipo de RNA não codificante, de baixa abundância, curto em comprimento (<200 nt), que carece de poliadenilação. As populações de RNA pequeno podem variar significativamente entre diferentes tipos de tecidos e espécies. Geralmente, os pequenos RNAs são formados pela fragmentação de sequências de RNA mais longas com a ajuda de conjuntos dedicados de enzimas e outras proteínas.

As pequenas RNAs atuam no silenciamento de genes e na regulação pós-transcricional da expressão genética. No entanto, as pequenas RNAs não são suficientes para a indução da interferência de RNA. Geralmente, precisam formar o núcleo do complexo RNA-proteína conhecido como complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). As siRNAs podem clivar o mRNA no meio do duplex mRNA-siRNA, e as metades resultantes do mRNA são degradadas por outras enzimas celulares. Ao contrário da via das siRNAs, a degradação mediada por miRNAs é iniciada pela remoção enzimática da cauda poliA do mRNA. As piRNAs são essenciais para o desenvolvimento das células germinativas. Foi demonstrado que as pequenas RNAs estão envolvidas em vários processos biológicos, incluindo desenvolvimento, proliferação e diferenciação celular, e apoptose.

Aproveitando uma produção tremenda com uma sensibilidade e faixa dinâmica sem precedentes, NGS pode identificar pequenos RNAs expressos de forma fraca, bem como revelar quantitativamente a heterogeneidade em comprimento e sequência. NGS é uma ferramenta poderosa para investigar a função de pequenos RNAs e prever potenciais moléculas-alvo de mRNA sem necessitar de genomas de referência disponíveis. A obtenção de uma biblioteca de sequenciação de pequenos RNAs de alta qualidade começa com a isolação de pequenos RNAs por fracionamento de tamanho utilizando seleção por eletroforese em gel ou colunas de sílica. Após a ligação do adaptador de RNA utilizando um adaptador de DNA adenilado 5' com uma extremidade 3' bloqueada, os pequenos RNAs são transcritos reversamente, amplificados por PCR e sequenciados. Para identificar e anotar miRNAs conhecidos, as leituras de sequenciação podem ser mapeadas para uma base de dados específica da espécie, como mirWalk e miRBase.

Vantagens do Nosso Serviço de Sequenciação de Pequenos RNAs

• Pequeno RNA e perfilagem de miRNA
• Compreender como a regulação pós-transcricional contribui para o fenótipo
• Identificação de mais pequenos RNAs não mapeados e isoformas, assim como novos biomarcadores.
• Alta Resolução, Alta Precisão: Detecção de diferenças de nucleotídeos únicos, contando com precisão desde algumas até dezenas de milhares de cópias.
• Alto Rendimento, Alta Qualidade: Obtenção de mais de 8 milhões de sequências em uma corrida de sequenciamento, curto período experimental, alta eficiência, baixo custo e qualidade fiável.
• Fluxo de Trabalho Analítico Padronizado: Equipas de bioinformática profissionais e serviços de análise para fornecer análises padronizadas, avançadas e personalizadas.
• Experiência extensa em sequenciação e análise de pequenos RNAs: Técnicos de sequenciação profissionais a ajudar no design experimental, resolução de problemas e análise de resultados.
• Protocolos de sequenciação de RNA pequeno personalizados: Adaptar planos de sequenciação de RNA pequeno personalizados de acordo com necessidades específicas.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de RNA Pequeno

A CD Genomics utiliza as plataformas Illumina HiSeq para sequenciar pequenos RNAs. Temos estratégias flexíveis para a descoberta e perfilagem de miRNA (15-30nt) e/ou pequenos RNAs (30-200nt). A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais. O fluxo de trabalho geral para sequenciação de pequenos RNAs está delineado abaixo.

Especificação de Serviço

	Requisitos de Amostra RNA total ≥ 1 μg, Quantidade Mínima: 200 ng, Concentração ≥ 20 ng/µl Células ≥ 2×106 Tecido ≥ 500 mg, Quantidade Mínima: 100 mg Relação OD A260/A280 ≥ 1.8, relação A260/230 ≥ 1.8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar livres de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são listados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciação Bibliotecas de miRNA (15-30nt), RNA pequeno (30-200nt) ou intervalo de tamanho personalizado. Illumina HiSeq SE50 ≥ 10 M leituras Mais de 90% das bases com um escore de qualidade ≥Q30
	Análise de Dados Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade de dados brutos e filtro de comprimento Mapeamento baseado em referência Classificação e quantificação de RNA pequeno Predição e anotação de genes-alvo Predição de pequenos RNAs novos Análise de genes-alvo de pequenos RNAs diferencialmente expressos (enriquecimento GO e enriquecimento KEGG) Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de RNA Pequeno para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece pacotes completos de serviços de sequenciação de pequenos RNAs, incluindo padronização de amostras, preparação de bibliotecas, sequenciação profunda, controlo de qualidade de dados brutos, montagem de genomas e análise bioinformática personalizada. Podemos adaptar este fluxo de trabalho aos seus interesses de pesquisa. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos. contacte-nos.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciamento

Distribuição A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

1. Qual é o fluxo de trabalho para a pré-processamento de dados?

Os primeiros passos são o corte de adaptadores usando o FASTX e uma correção opcional de k-mer usando o ECHO. Subsequentemente, o perfil de expressão é formado através do mapeamento e anotação do genoma. Se o número de leituras por amostra variar, a normalização é aplicada para compensar os efeitos de subamostragem.

2. Quantas leituras são necessárias para o sequenciamento de pequenos RNAs?

Depende da sua aplicação. Para perfilagem de expressão, uma faixa aceita para leituras mapeadas por amostra é de 100K-2M. Para aplicações de descoberta, devem ser considerados pelo menos 5-10M.

3. Quantos replicados biológicos preciso para cada condição?

Replicados biológicos podem aumentar a confiança e reduzir o erro experimental, e recomendamos que submeta pelo menos três replicados por amostra. Note que o número final de replicados é determinado pelas suas condições experimentais finais.

4. Como devo enviar amostras?

Pode enviar com gelo seco ou RNAstable à temperatura ambiente. Empiricamente, o envio de amostras de RNA em RNAstable resulta numa boa qualidade de RNA após a reconstituição.

5. Posso submeter E. coli células ou amostras de tecido?

Sim, além das RNAs, também pode submeter congelados. E. coli pelotas celulares ou tecidos com gelo seco.

6. É necessário enriquecimento de poli-A ou depleção de RNA para sequenciação de microRNA?

Nenhum enriquecimento é necessário para sequenciação de microRNA porque os adaptadores são ligados seletivamente apenas a pequenos RNAs.

7. Descobri que não conseguia abrir o ficheiro fastq descarregado.

Por favor, certifique-se de que o seu computador tem RAM suficiente para abrir os ficheiros grandes. Pode abri-los com um editor de texto em computadores Windows com RAM suficiente, ou em computadores Linux, que é uma opção preferida. Alternativamente, pode considerar outros leitores específicos para fastq.

Descoberta de microRNA novel através de sequenciação de RNA pequeno em cérebro humano pós-morte

Revista: BMC Genomics
Fator de impacto: 3,729
Publicado: 4 de outubro de 2016

Fundo

Os microARNs (miARNs) regulam a expressão génica principalmente através da repressão da tradução de moléculas de mRNA alvo. Mais de 2700 miARNs humanos foram identificados e alguns foram associados a fenótipos de doenças, mostrando padrões de expressão específicos de tecidos. Os autores realizaram estudos de sequenciação de pequenos RNAs em 93 amostras de córtex pré-frontal humano pós-morte de pacientes com doença de Huntington ou doença de Parkinson. E descobriram com sucesso 99 miARNs novos putativos.

Materiais e Métodos

Resultados

Figura 1. Representação em fluxograma do novo pipeline de descoberta de miRNA.

Um total de 8891 miARNs foram identificados.

A análise miRDeep* de dados de sequência de 93 amostras do córtex pré-frontal humano identificou 8891 miRNAs. 3641 miRNAs permaneceram após a filtragem para miRNAs conhecidos da miRBase v20, outros pequenos RNAs e exões. O restante foi filtrado pelo escore miRDeep*. Escores mais altos indicam maior confiança no resultado de um miRNA. No total, 99 miRNAs novos putativos foram finalmente identificados.

Figura 2. miRDeep* miARNs putativos e miARNs do miRBase (A), e localizações genómicas dos miARNs novos putativos (B).

2. Total de 99 putativos novos miARNs

Usando o alinhador SSEARCH, 34 dos 99 putativos novos miARNs maduros alinharam-se bem a pelo menos um miARN maduro presente na miRBase v20. A análise de expressão diferencial utilizando modelos lineares ajustados para a idade de morte mostrou que 4 dos 99 putativos miARNs estão diferencialmente expressos entre amostras de controlo e amostras de doença de Huntington, e que 3 estavam diferencialmente expressos entre amostras de controlo e amostras de doença de Parkinson (Tabela 2). Os dados detalhados são apresentados na Tabela 2, gerados pelo LIMMA v. 3.33.7.

Figura 3. MiARNs putativos novos, dados de replicação de miARNs e Londin et al.. miARNs.

Conclusão

Os autores desenvolveram um pipeline utilizando miRDeep*, sequenciação de RNA em pool e filtragem de pontuações para descobrir 99 miRNAs putativos novos a partir de 93 amostras de córtex pré-frontal humano pós-morte. Sete desses miRNAs foram validados experimentalmente, e 19 foram replicados em um conjunto de dados independente. Alguns miRNAs mostraram expressão diferencial entre amostras de HD e controle ou PD e controle, sugerindo papéis potenciais em doenças neurodegenerativas. Estas descobertas sublinham a diversidade dos miRNAs humanos, especialmente em contextos específicos de tecido, e suas potenciais implicações para a compreensão de doenças como HD e PD.

Referência:

1. Wake C, Labadorf A, Dumitriu A, et al.Descoberta de microRNA novel através de sequenciação de RNA pequeno no cérebro humano pós-morte. BMC Genomics, 2016, 17(1): 776.