Sequenciação de LncRNA

A CD Genomics está a oferecer um serviço de sequenciação de lncRNA de alto rendimento e custo-efetivo, combinando os mais recentes instrumentos de sequenciação da Illumina com análises bioinformáticas avançadas.

A Introdução da Sequenciação de LncRNA

Os longos RNAs não codificantes (lncRNAs) são definidos como uma classe grande e diversa de RNAs transcritos com tamanho superior a 200 nt que não codificam proteínas. Os lncRNAs estão amplamente distribuídos nos organismos e os transcritos de lncRNA representam a maior parte do transcriptoma não codificante. Os lncRNAs podem ser classificados em diferentes subtipos (incluindo antissensos, intergénicos, sobrepostos, intrónicos, bidireccionais e processados) com base na posição e direção da transcrição em relação a outros genes. Os lncRNAs assemelham-se aos mRNAs porque são tipicamente transcritos a partir de cromatina ativa, poliadenilados e com cap. No entanto, não direcionam a síntese de proteínas.

As lncRNAs são funcionalmente importantes para os organismos e não são meramente o produto de ruído transcricional. Uma miríade de funções moleculares das lncRNAs foram descobertas em mamíferos e plantas, incluindo reposicionamento de nucleossomas, remodelação da cromatina, controlo transcricional e processamento pós-transcricional. As lncRNAs estão cada vez mais implicadas na ocorrência de doenças, impressão genética e regulação do desenvolvimento. A caracterização da expressão génica e in situ Estudos de hibridização revelaram que a expressão de lncRNA é regulada durante o desenvolvimento, pode ser específica de tecido e tipo celular, e pode variar espacialmente, temporalmente ou em resposta a estímulos.

A aplicação de sequenciação de nova geração a tecnologia facilitou grandemente a descoberta e a análise funcional de lncRNAs. A informação de sequência de lncRNA pode ser obtida com resolução de base única através da preparação de bibliotecas, sequenciação de alto débito e poderosos bioinformática análise. Construímos a biblioteca de sequenciação através da remoção de rRNA, mantendo tanto lncRNAs como mRNAs. A análise da interação entre lncRNA e mRNA contribui para a iluminação das redes regulatórias de lncRNA.

Vantagens da Sequenciação de LncRNA

• Identifica características conhecidas e novas
• Permite o perfilamento de lncRNAs em uma ampla gama dinâmica.
• Explora novos biomarcadores e redes regulatórias de lncRNAs.

Aplicações do Sequenciamento de LncRNA

A sequenciação de LncRNA pode ser utilizada para, mas não se limita a, as seguintes pesquisas:

• Descoberta e Previsão de Novos lncRNAs;
• Investigação de Doenças;
• Análise de Redes Regulatórias.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de LncRNA

O fluxo de trabalho geral para o sequenciamento de lncRNA está descrito abaixo. Para construir a biblioteca de sequenciamento de lncRNA, o primeiro passo do sequenciamento de lncRNA é a depleção de rRNA, seguida pela fragmentação de RNA, síntese de cDNA, ligação de adaptadores, seleção de tamanho e enriquecimento por PCR. A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais.

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra RNA total ≥ 2 μg, Quantidade Mínima: 500 ng, Concentração ≥ 50 ng/µl Células ≥ 2×106 Tecido ≥ 500 mg, Quantidade Mínima: 100 mg Relação OD A260/A280 ≥ 1,8, relação A260/230 ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar isentas de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciação Preparação de biblioteca específica de fita Illumina HiSeq PE150 ≥10G de dados para genoma pequeno e ≥12G para genoma grande Mais de 80% das bases com um escore de qualidade ≥Q30
	Análise de Dados Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade de dados brutos e filtro de comprimento Mapeamento baseado em referência Predição de novos transcritos (incluindo lncRNAs) Quantificação e análise de expressão diferencial de lncRNAs e mRNAs Classificação da família lncRNA e anotação funcional de lncRNA Chamada de SNP/InDel, identificação de variantes de splicing Predição de alvos de lncRNA e análise de interação lncRNA-mRNA Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de LncRNA para a sua escrita (personalização)

A nossa equipa de bioinformática a nível de doutoramento fornece uma análise abrangente tanto para lncRNAs como para mRNAs, permitindo o acesso a informações sobre lncRNA e mRNA numa única corrida de sequenciação. Podemos ajudar no desenho experimental desde o início do seu projeto e oferecer consultoria em todas as etapas do processo do projeto.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciamento

Distribuição de A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontos PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

1. Quais espécies são apropriadas para estudos de sequenciação de lncRNA?

Para estudos de sequenciação de lncRNA, as espécies apropriadas devem cumprir os seguintes requisitos: (i) eucariotos; (ii) pelo menos um genoma de referência a nível de andaime disponível; (iii) anotações genómicas relativamente completas.

2. Por que remover rRNA ao construir bibliotecas de sequenciação de lncRNA?

O RNA ribossómico (rRNA) é o componente mais abundante do RNA total, representando 80% a 90% das moléculas numa amostra de RNA total de animais ou humanos. Para uma deteção eficiente de transcritos, os rRNAs altamente abundantes devem ser removidos antes da sequenciação.

3. Como prever os alvos de lncRNA?

Ambas as análises de co-localização e co-expressão de RNAs codificadores de proteínas e lncRNAs mostraram-se eficazes nas investigações da função potencial dos lncRNAs em processos biológicos e na previsão de alvos de lncRNAs. Quando a análise de co-localização considera os genes codificadores adjacentes que podem ser alvos de lncRNA, a análise de co-expressão considera os genes co-exprimidos como prováveis alvos de lncRNA, independentemente da localização.

4. Quais são as diferenças entre lncRNA e mRNA?

Os lncRNAs assemelham-se mARNs porque são tipicamente transcritos a partir de cromatina ativa, poliadenilados e com cap. No entanto, não direcionam a síntese de proteínas. Algumas diferenças entre lncRNA e mRNA estão resumidas na tabela abaixo.

Identificação de RNAs longos não codificantes enriquecidos nas ilhotas que contribuem para a falência das células β no diabetes tipo 2

Revista: Metabolismo Molecular
Fator de impacto: 6,799
Publicado: 23 de agosto de 2017

Resumo

Os autores identificaram aproximadamente 1500 lncRNAs novos, e alguns deles estavam diferencialmente expressos em ratos obesos. Dois lncRNAs (βlinc2 e βlinc3) estão altamente enriquecidos em células β, correlacionados com o ganho de peso corporal e níveis de glicemia em ratos obesos e modificados em ratos diabéticos db/db. Além disso, a expressão do ortólogo humano de βlinc3 foi alterada nas ilhotas de pacientes diabéticos tipo 2, associada ao IMC dos doadores. A modulação do nível dos dois lncRNAs por superexpressão ou downregulação em células MIN6 e ilhotas de rato aumentou as células β, mas não afetou a regulação da glicose.

Materiais e Métodos

Resultados

Análise de sequenciação de RNA

O sequenciamento de RNA resultou em 1558 lncRNAs novos, e alguns deles estavam diferencialmente expressos em ratos obesos. A anotação funcional mostrou enriquecimento para vias biológicas relacionadas à localização e transporte de proteínas, processos redox, bem como transporte intracelular.

Figura 1. Visão geral dos resultados de sequenciação de RNA. (A) Agrupamento hierárquico. Vermelho representa nenhuma distância e amarelo representa uma distância maior. ND denota dieta normal, HDR denota respondedores a dieta rica em gordura. (B) resumo dos genes expressos diferencialmente. (C) potencial de codificação para novos transcritos; (D) Distribuição do tamanho de genes codificadores de proteínas, lncRNAs conhecidos e novos. (E & F) Arquitetura do locus e isoformas de βlinc2 ou βlinc3.

2. Os níveis de expressão de βlinc2 e βlinc3

Figura 2. Os níveis de expressão de βlinc2 e βlinc3 são modificados em ilhéus de ratos alimentados com uma dieta rica em gordura e em ratos db/db.

Figura 3. Correlações da expressão de βlinc2 e βlinc3 com o peso corporal e a glicemia de ratos C57BL/6.

Figura 4. In vitro efeitos da glicose e palmitato cronicamente elevados no nível das duas lncRNAs expressas de forma diferencial em ilhotas de camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura.

Figura 5. A expressão de βlinc3 está diminuída em ilhéus de dadores com diabetes tipo 2.

Figura 6. A superexpressão e a regulação em baixa de βlinc2 e βlinc3 promovem a apoptose nas células β MIN6. (A) As células MIN6 foram transfectadas com um vetor de controlo ou plasmídeos para induzir a superexpressão de βlinc2 ou βlinc3. (B) As células foram transfectadas com um gapmer de controlo ou um gapmer para reduzir a expressão de βlinc3. (C e D) são a repetição do experimento em células de ilhota de rato dispersas. (E) As células MIN6 foram transfectadas com um plasmídeo que expressa p65 marcado com GFP.

Conclusão

Este artigo identificou um grande número de lncRNAs novos. Pelo menos dois deles podem afetar a sobrevivência das células β e podem contribuir para a toxicidade glucolipídica mediada pelas células β e para a manifestação e progressão do T2D. Assim, os lncRNAs podem fornecer alvos ideais para a prevenção e tratamento do diabetes.

Referência:

1. Motterle A, Gattesco S, Peyot M L, et al.Identificação de RNAs longos não codificantes enriquecidos em ilhéus que contribuem para a falência das células β no diabetes tipo 2. Metabolismo molecular, 2017, 6(11): 1407-1418.